Contador de células
En el contador de células: Células A431
La línea celular de carcinoma epidermoide A431 expresa niveles anormalmente altos del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y es un modelo útil para estudiar la señalización mediada por EGFR, que regula el crecimiento, la supervivencia, la proliferación y la diferenciación en las células de mamífero. La línea celular A431, obtenidas a partir de la epidermis de una paciente de 85 años y establecida por D. J. Giard et al., ha demostrado ser un valioso sistema modelo para examinar el ciclo celular, la apoptosis y el cáncer.
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Figura 1: Imágenes obtenidas con el citómetro SpectraMax MiniMax
Las células A431 se tiñeron con el colorante EarlyTox™ Live Red y posteriormente se obtuvieron las imágenes con el citómetro SpectraMax MiniMax. Las células se identificaron con una configuración personalizada definida por el usuario. Superior: imágenes de luz transmitida y fluorescencia roja superpuestas. Inferior: células identificadas mediante análisis StainFree (las máscaras de color púrpura muestran células identificadas por el software).
Figura 2: Recuentos celulares con StainFree frente a recuentos celulares con fluorescencia
Las células A431 se sembraron a densidades que oscilaban de 156 a 20 000 células por pocillo y los núcleos se tiñeron con colorante EarlyTox Live Red. Las imágenes se adquirieron en 4 sitios por pocillo y se seleccionó una región de interés en el centro de los pocillos para su análisis. A continuación se hizo un recuento utilizando el método StainFree (línea azul) o haciendo un recuento de núcleos fluorescentes rojos (línea roja).
Figura 3: Ensayo EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488
Se trataron las células A431 con diluciones en serie de estaurosporina (línea roja), camptotecina (línea verde) y etopósido (línea azul) durante 24 horas y, posteriormente, se analizó la apoptosis con el kit de ensayo EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView 488. Las células que expresaban caspasa-3/7 se tiñeron con fluorescencia verde; se adquirieron imágenes y se hizo el recuento con el citómetro SpectraMax MiniMax. Los resultados se representaron como recuento de células apoptóticas frente a concentración de compuesto con el software SoftMax Pro.
Consejo:
Las células A431 tienen una morfología epitelial y tienden a crecer en grupos, lo que dificulta un poco su recuento. Para el recuento con el método StainFree utilice la función "Create New Setting" (Crear nueva configuración) y utilice la herramienta de dibujo amarilla para dibujar el contorno de las células sin salirse de los límites de la célula. Utilice la herramienta de dibujo azul para indicar las áreas sin células y cualquier artefacto.
Kit de herramientas de análisis de células A431
- Plataforma de detección de microplacas multimodo SpectraMax® i3
- Citómetro con adquisición de imágenes SpectraMax® MiniMax™ 300
- Software SoftMax® Pro
Luz transmitida (LT)
713 nm (fluorescencia roja)
Exposición a LT: 7 ms
Ajuste del foco de LT: 0 µm
Exposición 713: 12 ms
Ajuste del foco de 713: 20 µm
Tipo de análisis: “Discrete Object Analysis” (Análisis de objetos definidos)
Longitud de onda para la búsqueda de objetos: LT (StainFree) o 713 (núcleos rojos)
LT: Create new setting (Crear nueva configuración) (personalizado)
713: Definir tamaño e intensidad: Tamaño = 10-30 µm, Intensidad por encima del fondo = 70
Acerca de la tecnología de detección de células StainFree
Los ensayos basados en la adquisición de imágenes celulares normalmente requieren el uso de sondas fluorescentes que pueden ser tóxicas o funcionar únicamente en células fijadas. Un método sin marcaje para analizar recuentos celulares y la confluencia celular permite a los investigadores monitorizar cuantitativamente la proliferación celular y la salud de las células sin necesidad de flujos de trabajo laborioso que pueden alterar la viabilidad celular.
La plataforma de microplaca multimodo SpectraMax i3/i3x con el citómetro con adquisición de imágenes MiniMax 300 utiliza la exclusiva tecnología de detección de células StainFree pendiente de patente que le permite realizar ensayos de proliferación celular, citotoxicidad y otros ensayos sin tinciones nucleares como DAPI, que se intercala en el ADN, o colorantes de células vivas que son realmente tóxicos para las células a largo plazo.