Contador de células
En el contador de células: Células HUVEC
Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) son células primarias aisladas de la vena del cordón umbilical. Constituyen un sistema modelo para estudiar la función de las células endoteliales, con aplicaciones como hipoxia, inflamación, estrés oxidativo, respuesta a la infección y angiogénesis normal y asociada a tumor. La activación de células endoteliales, una respuesta inflamatoria, se puede inducir con citoquinas como el TNF-α e IFN-γ y tiene como consecuencia el aumento de moléculas de adhesión celular como VCAM-1/CD106, cuyo aumento puede cuantificarse con anticuerpos marcados con fluorescencia y la adquisición de imágenes celulares.
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Figura 1: Recuentos celulares StainFree
Se adquirieron imágenes de las células HUVEC con el citómetro con adquisición de imágenes SpectraMax i3 MiniMax 300 y las células se identificaron a partir de imágenes con luz transmitida utilizando la configuración de análisis “CellsB” (Células B) predefinida. A la izquierda se muestran las imágenes originales con luz transmitida y a la derecha, las mismas imágenes con máscaras púrpura que indican las células identificadas por el software. Se muestran las células sembrada a alta densidad (fila superior) y a baja densidad (fila inferior).
Figura 2: Recuentos celulares StainFree frente a recuentos nucleares con fluorescencia
Las células HUVEC sembradas a densidades que oscilaban de 156 a 20 000 células por pocillo se contaron con la tecnología StainFree (círculos azules) o se tiñeron con el colorante EarlyTox™ Live Red y se contaron los núcleos fluorescentes rojos (círculos rojos). Los recuentos celulares obtenidos con ambos métodos coincidían bastante en el rango completo de densidades celulares.
Figura 3: Expresión de VCAM-1/CD106 inducida por citoquinas en células HUVEC
Las células HUVEC tratadas con las citoquinas TNF-α e IFN-γ (izquierda) o sin tratar (derecha) se tiñeron con un anticuerpo frente a VCAM-1/CD106 marcado con FITC y las imágenes se obtuvieron con el citómetro con adquisición de imágenes SpectraMax MiniMax 300.
Figura 4: Inhibición de la expresión de VCAM-1/CD106 inducida por citoquinas en células HUVEC
Las células HUVEC se sembraron a 10 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se dejó que se adhirieran y crecieran durante toda la noche. Se trataron con las citoquinas TNF-α e IFN-γ, así como con diferentes concentraciones del inhibidor de la MAP quinasa p38, SB202190, durante 24 horas y, posteriormente, se tiñeron con un anticuerpo frente a VCAM-1/CD106 marcado con FITC. Se incluyeron controles sin inhibidor ni citoquinas.
Consejo:
Las células HUVEC tienen una apariencia típica de empedrado. Para el recuento StainFree, funciona muy bien la configuración predeterminada “CellsB” (Células B) en la configuración de análisis de imágenes del software SoftMax Pro. Alternativamente, al hacer recuentos de células cuya morfología ha cambiado debido al tratamiento con citoquina, etc., puede ser útil la creación de una nueva configuración de análisis dibujando sobre las imágenes de las células.
Kit de herramientas de análisis de células HUVEC
- Plataforma de detección de microplacas multimodo SpectraMax® i3
- Citómetro con adquisición de imágenes SpectraMax® MiniMax™ 300
- Software SoftMax® Pro
Tipo de análisis: “Discrete Object Analysis” (Análisis de objetos definidos)
Longitud de onda para la búsqueda de objetos: LT
Acerca de la tecnología de detección de células StainFree
Los ensayos basados en la adquisición de imágenes celulares normalmente requieren el uso de sondas fluorescentes que pueden ser tóxicas o funcionar únicamente en células fijadas. Un método sin marcaje para analizar recuentos celulares y la confluencia celular permite a los investigadores monitorizar cuantitativamente la proliferación celular y la salud de las células sin necesidad de flujos de trabajo laborioso que pueden alterar la viabilidad celular.
La plataforma de microplacas multimodo SpectraMax i3 con el citómetro con adquisición de imágenes MiniMax 300 utiliza la exclusiva tecnología de detección de células StainFree pendiente de patente que le permite realizar ensayos de proliferación celular, citotoxicidad y otros ensayos sin tinciones nucleares como DAPI, que se intercala en el ADN, o colorantes de células vivas que son realmente tóxicos para las células a largo plazo.