En Dementia Research Institute de la Universidad de Cardiff utilizan el sistema FLIPR Penta para estudiar el papel de la microglía en la enfermedad de Alzheimer
“FLIPR Penta supera la eficiencia de un microscopio invertido al permitirme obtener imágenes de una cantidad significativamente mayor de células y muestras. Sorprendentemente, me permite capturar aproximadamente 100 veces más muestras al día”.
Dra. Emily Maguire
COMPAÑÍA/UNIVERSIDAD
Universidad de Cardiff, Dementia Research Institute
MIEMBROS DEL EQUIPO
Dra. Emily Maguire,
Dra. Nina Stöberl,
Dra. Hazel Hall-Roberts,
Dra. Bethany Shaw,
Sra. Rachel O’Donoghue,
Sra. Jincy Winston
PRODUCTOS UTILIZADOS
Sistema de cribado celular de alto rendimiento FLIPR Penta
Cabezal de 384 pocillos para FLIPR Penta
Kit de ensayo FLIPR Calcium 6
El reto
La Dra. Emily Maguire y su equipo del Dementia Research Institute en la Universidad de Cardiff (Reino Unido) tienen como objetivo identificar las causas de la enfermedad de Alzheimer lo cual mejorará el cuidado, el diagnóstico y, finalmente, el tratamiento de los pacientes.
La investigación de la Dra. Maguire se centra en identificar las diferencias entre las células del cerebro de personas con y sin enfermedad de Alzheimer. Específicamente, están investigando una clase característica de células inmunes cerebrales conocidas como microglía, que se han revelado como células cruciales que contribuyen a la progresión de la enfermedad de Alzheimer. La Dra. Maguire utiliza el análisis genético para estimar el riesgo de Alzheimer y recoge muestras de sangre de los dos grupos: personas con bajo riesgo y personas con alto riesgo ya afectadas por la enfermedad. Las células sanguíneas se transforman en células madre y, posteriormente, se diferencian en microglía. Este enfoque permite al equipo comparar la microglía de personas con alto y con bajo riesgo e identificar las diferencias relacionadas con la enfermedad de Alzheimer. Esta investigación podrá permitir a los científicos desarrollar tratamientos específicos para la enfermedad de Alzheimer en el futuro.
“Para adquirir imágenes de una muestra en el microscopio invertido con el mismo número de repeticiones que con el sistema FLIPR Penta, necesitaría en torno a 3 horas de tiempo de manipulación (más 1,5 horas para cargar el colorante de calcio). Sin embargo, con FLIPR Penta puedes adquirir imágenes de 30 veces más muestras en aproximadamente 30 minutos de tiempo de manipulación (más la carga del colorante de calcio). Esto simplifica significativamente el proceso de obtención de repeticiones”.
– Dra. Emily Maguire
La solución
El equipo utilizó FLIPR Penta para comparar la respuesta de la microglía de pacientes con alto riesgo de Alzheimer con la respuesta de pacientes con bajo riesgo de sufrir esta enfermedad cuando se exponían a moduladores de calcio conocidos. Estas comparaciones tenían como objetivo identificar discrepancias en la señalización del calcio entre células enfermas y no enfermas, lo que probablemente arrojará luz sobre la patología subyacente.
El método implicaba sembrar las células en una placa de 384 pocillos y teñirlas con el colorante verde Calcium 6 de Molecular Devices. Tras la incubación, cargaban un compuesto específico (p. ej., ATP) en otra placa. Se colocaron ambas placas en FLIPR Penta, el cual añadía el compuesto a las células y registraba los cambios en la fluorescencia tanto antes como durante los 5 minutos siguientes a la adición del compuesto. Esto permitía al equipo medir el calcio liberado tras la aplicación del compuesto y, por tanto, el nivel de señalización celular. Para estandarizar los resultados, el equipo también capturó una imagen de la placa de células y normalizó las mediciones de fluorescencia en función del número de células de cada pocillo, lo que les permitió obtener comparaciones exactas y fiables entre pocillos.
“FLIPR Penta nos permite analizar un gran número de muestras, hasta 24 por experimento en una placa de 384 pocillos, minimizando a la vez la variabilidad resultante de las fluctuaciones en factores externos entre experimentos. Además, el instrumento FLIPR nos permite administrar cantidades precisas de reactivos (especialmente ATP en nuestro caso) a cada pocillo simultáneamente, lo que garantiza la uniformidad entre todos los pocillos y mejora sistemáticamente nuestras mediciones”.
– Dra. Emily Maguire
Al investigador le lleva aproximadamente 2 horas preparar una placa para un ensayo de calcio en FLIPR, aunque gran parte de este tiempo es solo la incubación con el colorante. La adquisición real de imágenes de una placa tarda 10 minutos. Por esta razón, escalonando la tinción con Calcium 6, sería posible adquirir imágenes de más de 50 placas al día.
Sistema de cribado celular de alto rendimiento FLIPR Penta
Kits de ensayo FLIPR Calcium
Productos utilizados
Sistema de cribado celular de alto rendimiento FLIPR Penta y kits de ensayo FLIPR Calcium
Los resultados
Aunque la investigación no es concluyente, los resultados preliminares mostraron una posible disparidad en la señalización del calcio mediada por ATP entre los dos grupos.
“Al realizar más experimentos utilizando la técnica FLIPR Penta con una mayor variedad de líneas celulares derivadas de pacientes, podemos mejorar la solidez de nuestro trabajo y obtener potencialmente resultados más concluyentes”.
– Dra. Emily Maguire
Si se observan variaciones significativas, podemos sugerir que la señalización del calcio mediada por ATP desempeña un papel importante en la enfermedad de Alzheimer, lo que posiblemente abre nuevas vías para el desarrollo de tratamientos.
A. La gráfica muestra cómo existía una tendencia no significativa hacia una mayor liberación de calcio tras la adición de ATP en la microglía con alto riesgo de Alzheimer en comparación con las células con bajo riesgo. Estos datos se obtuvieron con un grupo preliminar de 9 líneas de células madre (6 con alto riesgo y 3 con bajo riesgo). Los diferentes colores indican células procedentes de distintos individuos y las diferentes formas indican diferentes replicados del experimento.
B. Imagen de microscopía de fluorescencia de la microglía teñida con el colorante Calcium 6.
Además del ATP, el equipo identificó varios mediadores en las células que tienen una función crucial en la movilización del calcio. Por lo tanto, en investigaciones futuras se podrán explorar los efectos de introducir diferentes moléculas que se sabe inducen la liberación del calcio a través de distintos mecanismos, como por ejemplo, otros nucleótidos como ADP y UDP que se unen a diferentes receptores. La idea es que al comparar las respuestas de la microglía con alto o bajo riesgo de enfermedad de Alzheimer a estos activadores alternativos, el equipo podrá evaluar si existen algunas diferencias entre los dos grupos.
Assaying Microglia Functions In Vitro | UK Dementia Research Institute