En el Oxford Drug Discovery Institute se utiliza el sistema FLIPR para explorar los mecanismos terapéuticos de enfermedades neurodegenerativas
COMPAÑÍA/UNIVERSIDAD
Oxford Drug Discovery Institute fundado por Alzheimer’s Research UK, Universidad de Oxford
MIEMBROS DEL EQUIPO
Dra. Franziska Guenther,
Dra. Katherine England,
Dr. James Taylor,
Dra. Emma Mead,
Prof. Paul Brennan,
Prof. John Davis,
Dra. Emma J. Murphy
PRODUCTOS UTILIZADOS
Sistema de cribado celular de alto rendimiento FLIPR Tetra
Software ScreenWorks
El reto
El equipo de investigación de la Dra. Emma J. Murphy se dedica a explorar enfoques terapéuticos para enfermedades neurodegenerativas. Para ello, estudian los efectos de inhibidores de la proteasa específica de ubiquitina 30 (USP30), los cuales han mostrado su potencial como enfoque terapéutico para favorecer la mitofagia (la eliminación de mitocondrias dañadas) en trastornos neurodegenerativos.
Para realizar estos cálculos mediante caracterización cinética de alto rendimiento, el equipo ha desarrollado un ensayo bioquímico usando el instrumento FLIPR® Tetra. Antes de usar FLIPR® Tetra, el equipo utilizaba un lector de microplacas de otro fabricante para monitorizar la escisión del sustrato denominado Ub-Rho por la USP30. Este método, basado en la medición del incremento de la fluorescencia, resultó excelente para determinar los valores de IC50 (la concentración del inhibidor que reduce la actividad enzimática al 50 %) con un alto rendimiento. Sin embargo, el método presentaba limitaciones en el acceso a puntos temporales iniciales y en la realización de mediciones cinéticas. Esto se debía a que había que añadir el sustrato a la placa antes de colocarla en el instrumento y los pocillos de la placa se leían individualmente.
La solución
Adquirido originalmente para monitorizar el flujo de calcio de las células, se ha demostrado que FLIPR Tetra es una herramienta excepcional para investigar la cinética enzimática. Además de ensayos del flujo de calcio, el equipo realiza en la actualidad diversos ensayos bioquímicos usando FLIPR Tetra, como el ensayo de producción de fosfato y el ensayo fluorogénico de desubiquitinasa mencionado anteriormente.
FLIPR Tetra ha servido como una plataforma inestimable para el equipo, permitiéndoles realizar ensayos de cinética bioquímica de alto rendimiento. A través de este enfoque, han podido generar datos sólidos y fiables y al mismo tiempo determinar rápidamente parámetros cinéticos intrincados. El rendimiento mejorado conseguido con este método permite al equipo incorporar datos cinéticos en procesos críticos de toma de decisiones mucho más pronto en el proceso de descubrimiento de fármacos.
Productos utilizados
Sistema de cribado celular de alto rendimiento FLIPR Penta y software ScreenWorks
Los resultados
A) El equipo ha realizado capturas de pantalla en las que se muestra el incremento de fluorescencia con el tiempo cuando el sustrato Ub-Rho fluorogénico se escinde por la acción de la enzima con diferentes concentraciones del inhibidor (izquierda). Del mismo modo, también han realizado capturas de pantalla de la placa completa en las que se muestra el impacto de 16 inhibidores diferentes por duplicado (derecha).
Para entender a fondo el potencial terapéutico de la inhibición de USP30 como mecanismo para tratar las enfermedades neurodegenerativas, es necesario realizar más estudios de eficacia utilizando estos inhibidores en modelos celulares y animales relevantes. Estas investigaciones arrojarán luz sobre el perfil cinético deseado de la inhibición de USP30 y su eficacia para combatir las enfermedades neurodegenerativas.