El equipo de Visikol desarrolla modelos de cultivo celular 3D para estimular el proceso de progresión de la EHNA y la EHGNA con el sistema de adquisición de imágenes de alto contenido ImageXpress Micro Confocal y el software MetaXpress

El reto

En el estudio de la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y la enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA), existe una gran necesidad de un modelo in vitro que permita a los investigadores descartar posibles tratamientos durante ensayos in vitro de rendimiento medio y bajo coste. Las enfermedades hepáticas afectan a millones de personas anualmente en Estados Unidos, pero aún existen pocos tratamientos efectivos. Visikol está centrado en cambiar el paradigma de cómo se analizan los tejidos y las células desde un enfoque cualitativo dirigido por la acción humana a un enfoque cuantitativo dirigido por la visión de un ordenador. Ofrecen servicios a clientes de la industria farmacéutica y biotecnología para ayudarlos a acelerar sus iniciativas de descubrimiento de fármacos y reducir la brecha traslacional entre los estudios in vitro e in vivo mediante el uso de modelos de cultivo celular y técnicas de análisis avanzados.

Se sabe que las primeras fases de la EHNA y la EHGNA son reversibles y los investigadores se han esforzado por desarrollar tratamientos para revertir este proceso. Una de las principales dificultades para desarrollar estos tratamientos es que no existían modelos in vitro predictivos que representaran con exactitud al hígado y la progresión de la EHNA y la EHGNA in vitro. Debido a esta falta de modelos in vitro, ha habido varios fracasos en ensayos clínicos en las últimas fases, y el coste y el tiempo para desarrollar estos tratamientos han sido significativos.

Además, la adquisición de imágenes de modelos de cultivo celular 3D es problemática ya que el material biológico dispersa la luz de forma efectiva y la calidad de la imagen se deteriora rápidamente en muestras más gruesas. Por otro lado, el procesamiento de conjuntos de datos tridimensionales puede ser difícil para conseguir el marcaje uniforme de tejido 3D.

La solución

Para la adquisición de imágenes, Visikol utiliza el sistema de adquisición de imágenes de alto contenido ImageXpress® Micro Confocal, que permite a los investigadores visualizar completamente modelos de cultivo celular 3D, o esferoides, en su totalidad cuando se combina con Visikol® HISTO-M^™. El software de adquisición y análisis de imágenes de alto contenido MetaXpress® proporciona la disposición de cada pocillo de la placa (cada pocillo con un único esferoide). El equipo de Visikol seleccionó la longitud de onda de luz correcta para excitar los fluoróforos en el modelo, que emitía una longitud de onda de luz diferente que era capturada por la cámara del generador de imágenes. Siguió la umbralización manual, que permitió la identificación de regiones con tinción positiva para colágeno. Normalmente, la adquisición de imágenes se realiza con 20 cortes Z, lo que permite a la cámara capturar el rango completo del esferoide que de promedio tiene de 150 a 250 micras de grosor. La compactación de los cortes Z usando la emisión de intensidad máxima de cada corte permitió la creación del Z-stack que era una compilación de las emisiones más brillantes de cada corte en una única imagen. Las imágenes resultantes permitieron la visualización de múltiples canales inmunomarcados, incluidos albúmina, vimentina, CD68, CD31, y DAPI.

La adquisición de imágenes de los modelos permitió a los investigadores visualizar cómo interaccionan los compuestos con las células y entender cómo un compuesto podría afectar a las personas en los ensayos clínicos. El aspecto importante de los modelos 3D para la EHNA es el análisis del tejido cicatricial que se forma en el modelo. Las imágenes también pueden revelar la viabilidad de las células del modelo en relación con los compuestos del cliente.

Software de adquisición y análisis de imágenes de alto contenido MetaXpress

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Sistema de adquisición de imágenes de alto contenido ImageXpress Micro Confocal

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Productos utilizados

El sistema ImageXpress Micro Confocal es una solución de alto contenido que puede intercambiar entre la adquisición de imágenes de campo amplio y confocal de células vivas y fijadas. Puede capturar imágenes de alta calidad de organismos completos, tejidos gruesos, modelos 2D y 3D y eventos celulares o intracelulares. El confocal con disco giratorio y la cámara sCMOS permite la adquisición de imágenes de eventos rápidos y raros como el latido de células cardíacas y la diferenciación de células madre. Con el software MetaXpress, el sistema permite numerosas aplicaciones de adquisición de imágenes confocales desde el desarrollo de ensayos 3D al cribado.

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Los resultados

El equipo de Visikol ha desarrollado varios modelos de cultivo celular 3D que recrean el microambiente del tejido en el hígado para simular el proceso de progresión de la EHNA y la EHGNA. Estos modelos se evalúan usando la adquisición de imágenes de alto contenido confocales 3D con otras lecturas y diversos tratamientos para identificar hasta qué grado mejoran el proceso de fibrosis asociado a la EHNA.

Los esferoides 3D de HepaRG de Visikol y cocultivo con células no parenquimatosas se pretrataron con vehículo o un inhibidor de ALK-5 durante 1 hora antes de inducir la fibrosis con TGF-β 100 nM durante 48 horas. En las imágenes anteriores, DAPI es azul, el indicador de viabilidad es verde y el pan-colágeno es rojo. La intensidad de fluorescencia del pan-colágeno y el volumen se cuantificaron para cada modelo de cultivo celular 3D como se describe anteriormente. Se puede ver que el TGF-β reduce la viabilidad celular y el tamaño del esferoide y, además, inicia el depósito de colágeno, mientras que el inhibidor de ALK-5 es capaz de atenuar parcialmente ambas reducciones (la viabilidad celular y el depósito de colágeno).