Ensayos de detección de contaminantes
Bajo la marca Threshold, hay disponibles dos kits de ensayo de detección de contaminación: ensayo Threshold® Immunoligand (ILA) y ensayo Threshold® Total DNA
El ensayo Threshold Immunoligand mide una gran variedad de analitos, como proteínas, péptidos, ADN específico de secuencia y microorganismos para el desarrollo y producción de productos biofarmacéuticos. Las muestras pueden variar desde sobrenadantes de fermentación, muestras de un proceso de purificación y otras preparaciones bioquímicas, hasta suero u otros líquidos corporales. Los ensayos se pueden desarrollar usando un formato tipo sándwich o competitivo, dependiendo del tamaño y las características del analito que se mide.
El ensayo Threshold Total DNA mide cuantitativamente picogramos de ADN monocatenario. A diferencia de las técnicas de hibridación que requieren sondas o cebadores de ADN con una secuencia de ácidos nucleicos específica, el ensayo Threshold Total DNA mide el ADN con una especificidad amplia de secuencia. Esto permite al sistema Threshold medir el ADN de células huésped, así como otro ADN que podría haber sido introducido durante el proceso de fabricación de productos biofarmacéuticos. Además, puesto que el ensayo no requiere sondas ni cebadores específicos de secuencia, se puede aplicar fácilmente a diferentes muestras purificadas a partir de diferentes organismos huésped.
Tecnología de los ensayos de detección de contaminantes
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Ensayo Threshold® Immunoligand (ILA)
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En la fase de reacción, los anticuerpos marcados, la muestra que contiene el analito, la estreptavidina y el conjugado antifluoresceína/ureasa proporcionados en el kit de detección ILA se incuban para formar un complejo de reacción. Puesto que esta unión se produce en solución, todas las moléculas se mantienen en su conformación nativa para garantizar la medición exacta del analito y el 100 % de actividad de los anticuerpos. De forma similar, en el ensayo Total DNA se forma un complejo de reacción cuando la proteína biotinilada de unión a ADN monocatenario y el anticuerpo anti-ADNmc, conjugado con ureasa, se unen sin especificidad de secuencia al ADN monocatenario. Todos los componentes del ensayo se incluyen en el kit de ensayo Total DNA completo.
Durante la fase de separación, se utiliza la fuerte afinidad de la estreptavidina por la biotina para capturar y concentrar los complejos de reacción sobre una membrana biotinilada mediante un paso de filtración. La estación de trabajo Threshold contiene cuatro unidades de filtración de 8 canales con la posibilidad de añadir dos colectores auxiliares para una filtración simultánea total de 96 muestras.
En la fase de detección, el complejo de reacción capturado sobre la membrana se coloca en el lector Threshold que contiene el sustrato urea y el sensor potenciométrico direccionable por luz (light-addressable potentiometric sensor, LAPS). Dentro del lector, la urea es hidrolizada por la ureasa, produciendo un cambio de pH en un microvolumen de menos de 1 µl. El sensor detecta simultáneamente la actividad ureasa de ocho muestras diferentes durante una medición cinética de 90 segundos. La extrema sensibilidad, precisión y reproducibilidad del sistema Threshold® se debe a la combinación del pequeño volumen de muestra con el sensor de bajo ruido.
Ensayo Threshold® Total DNA
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En la fase de reacción, los anticuerpos marcados, la muestra que contiene el analito, la estreptavidina y el conjugado antifluoresceína/ureasa proporcionados en el kit de detección ILA se incuban para formar un complejo de reacción. Puesto que esta unión se produce en solución, todas las moléculas se mantienen en su conformación nativa para garantizar la medición exacta del analito y el 100 % de actividad de los anticuerpos. De forma similar, en el ensayo Total DNA se forma un complejo de reacción cuando la proteína biotinilada de unión a ADN monocatenario y el anticuerpo anti-ADNmc, conjugado con ureasa, se unen sin especificidad de secuencia al ADN monocatenario. Todos los componentes del ensayo se incluyen en el kit de ensayo Total DNA completo.
Durante la fase de separación, se utiliza la fuerte afinidad de la estreptavidina por la biotina para capturar y concentrar los complejos de reacción sobre una membrana biotinilada mediante un paso de filtración. La estación de trabajo Threshold contiene cuatro unidades de filtración de 8 canales con la posibilidad de añadir dos colectores auxiliares para una filtración simultánea total de 96 muestras.
En la fase de detección, el complejo de reacción capturado sobre la membrana se coloca en el lector Threshold que contiene el sustrato urea y el sensor potenciométrico direccionable por luz (light-addressable potentiometric sensor, LAPS). Dentro del lector, la urea es hidrolizada por la ureasa, produciendo un cambio de pH en un microvolumen de menos de 1 µl. El sensor detecta simultáneamente la actividad ureasa de ocho muestras diferentes durante una medición cinética de 90 segundos. La extrema sensibilidad, precisión y reproducibilidad del sistema Threshold® se debe a la combinación del pequeño volumen de muestra con el sensor de bajo ruido.
Recursos de los ensayos de detección de contaminantes
Nota de aplicación
Cuantificación del ADN residual en productos finales biofarmacéuticos usando el sistema de ensayo Threshold Total DNA. Validación del ensayo y determinación del límite de detección
Quantitation of residual DNA in final product biopharmaceuticals using the Threshold Total DNA assay system. Assay validation and determination of detection limit
La FDA recomienda que todas las pruebas de control de calidad utilizadas para la liberación de productos biofarmacéuticos sigan las directrices actualizadas de Buenas Prácticas de Fabricación (BPFa) definidas en el Título 21...
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Nota de aplicación
Un método de extracción de ADN sin fenol
A phenol-free DNA extraction method
Se evaluó un método de extracción de ADN usando un kit de extracción disponible en el mercado para el pretratamiento de muestras biofarmacéuticas que se van a analizar con el ensayo Threshold® Total DNA. Esto...
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Nota de aplicación
Ensayo de ADN específico de secuencia
Sequence-Specific DNA Assay
El sistema Threshold® permite la medición de secuencias de ADN específicas. Se utilizan sondas biotiniladas y fluoresceinadas específicas de la secuencia diana...
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Nota de aplicación
Ensayo de contaminante proteína G
Protein G contaminant assay
La proteína G, purificada a partir de la pared celular de estreptococos del grupo G, es una proteína de 30 000-35 000 daltons que se une a la región Fc de los anticuerpos1. Esta característica se utiliza para...
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Nota de aplicación
Ensayo de contaminante proteína A
Protein A contaminant assay
La proteína A, purificada a partir de la pared celular de S. aureus, es una proteína de 42 000 daltons. Tiene cuatro sitios de unión para la región Fc de los anticuerpos, de los cuales solo dos pueden ocuparse...
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Nota de aplicación
Optimización del marcaje de proteínas
Optimizing the labeling of proteins
El ensayo Threshold® Immuno-Ligand (ILA) adapta los reactivos utilizado en ensayos de ELISA, RIA o de radiorreceptores para el sistema Threshold uniendo covalentemente biotina o fluoresceína a...
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Nota de aplicación
Ensayo de transferrina humana contaminante
Contaminant human transferrin assay
La transferrina humana es una glucoproteína de 80 000 daltons que se encuentra en el suero humano y facilita el transporte de hierro entre las células. La forma sin hierro, la apotransferrina, se combina con el ion Fe2+...
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Nota de aplicación
Ensayo de proteínas derivadas de células huésped contaminantes
Contaminant host cell-derived protein assay
Los polipéptidos, que no sean el producto biológico de interés, producidos por la célula huésped durante el cultivo celular o la fermentación (“proteínas derivadas de células huésped” o “HCP”) pueden causar...
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Nota de aplicación
Ensayo de BSA contaminante
Contaminant BSA assay
La albúmina sérica bovina (BSA), una proteína de 63 000 daltons, es uno de los principales constituyentes del suero bovino. En los medios de cultivo celular de células de mamífero se puede usar suero de ternera fetal que contiene BSA para...
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Nota de aplicación
Ensayo de transferrina bovina contaminante
Contaminant bovine transferrin assay
La transferrina bovina, una glucoproteína de 76 000 daltons, es uno de los constituyentes del suero bovino. La transferrina que se encuentra en el suero se puede asociar con iones de hierro. La forma saturada con hierro se...
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Nota de aplicación
Ensayo de IgG bovina contaminante
Contaminant bovine IgG assay
La IgG bovina, una proteína de 160 000 daltons, es uno de los constituyentes del suero bovino. En los medios de cultivo celular de células de mamífero se utiliza frecuentemente suero de ternera fetal que contiene IgG para...
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Nota de aplicación
Aplicaciones de inmunoensayos rápidos (FAST ILA) en cultivo celular/fermentación y desarrollo del proceso usando el sistema Threshold
Applications of rapid immunoassays (FAST ILA) in cell culture/fermentation and process development using the Threshold System
La medición exacta de la concentración de un producto biológico es importante en la monitorización de biorreactores/fermentadores, procesamiento posterior y control de calidad del producto final. Actualmente,...
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Nota de aplicación
Cualificación de ADNasa I y tratamiento de la muestra
DNAse I qualification and sample treatment
El ensayo Threshold Total DNA cuantifica el ADN contaminante en fármacos biofarmacéuticos. La ADNasa I se puede usar junto con el ensayo Total DNA con dos propósitos: Para validar que...
