Soluciones para lectores de microplacas

¿Necesito un lector de modo único o un lector multimodo?

Si está realizando únicamente un solo tipo de lectura (solo absorbancia, fluorescencia o luminiscencia), entonces un lector de modo único será lo más apropiado para usted. No obstante, si cree que sus necesidades pueden cambiar o está realizando diferentes aplicaciones con distintos tipos de lectura, entonces lo mejor para usted sería un lector multimodo.

¿Qué fuentes de luz hay disponibles y cuál debería elegir?

Hay tres fuentes de luz disponibles: lámpara de flash, LED y láser.

Una lámpara de flash de xenón proporcionará una intensidad considerable en un rango muy amplio de longitudes de onda de luz (200-1000 nm). En general, será más eficiente en el rango visible, aunque también se puede utilizar en los rangos ultravioleta (UV) e infrarrojo cercano.

Los LED se pueden usar como fuente de luz en el rango espectral de 375 a 1000 nm. La mayoría de los LED tienen un ancho de banda estrecho, entre 20 y 50 nm, y están pensados para un rango específico. Estos generan una intensidad de luz mayor que la mayoría de lámparas de flash de xenón, por lo que pueden proporcionar mayor sensibilidad para determinados ensayos. Los LED también tienen una vida útil muy larga.

Los láseres proporcionan una intensidad mucho más alta y se usan para aplicaciones específicas, como AlphaScreen, en la que se necesita mucha energía a una longitud de onda específica.

En general, los LED le proporcionarán mejor rendimiento que las lámparas de flash. Sin embargo, las generaciones más nuevas de instrumentos, como el lector de microplacas multimodo SpectraMax® iD5, que tiene una lámpara de flash de alto rendimiento (alta intensidad) le proporcionarán un rendimiento similar al de un lector con LED. Si no desea tener que elegir entre las fuentes de luz, puede optar por un sistema como nuestro lector de microplacas multimodo SpectraMax i3x, que ofrece las tres, de modo que usted pueda seleccionar la mejor para su aplicación.

¿Necesito filtros o monocromadores?

Los monocromadores y los filtros son dos tecnologías diferentes de selección de longitud de onda que son parte integral del diseño del lector de microplacas.

En un instrumento basado en filtros, se incorporan filtros ópticos con longitudes de onda específicas en la óptica de excitación y emisión. Además, un divisor de haz, como un espejo dicroico (o filtro semitransparente) pasará la luz de excitación por la muestra y permitirá que la luz de emisión atraviese el filtro de emisión para que se pueda detectar la señal. Con este diseño, la pérdida de señal es mínima, así como la separación efectiva de las longitudes de onda de excitación y emisión.

Los instrumentos basados en monocromadores tienen un diseño más complejo que puede variar entre instrumentos. En general, un monocromador consta de una ranura de entrada, un elemento dispersor (como un prisma o una rejilla holográfica) y una ranura de salida. Los monocromadores se usan para filtrar la luz de excitación y de emisión. Una red de difracción separa la luz blanca en un espectro, de modo que la ranura de salida aísla una longitud de onda de luz específica para excitar la muestra. Dentro de la ranura de salida, un elemento dispersor giratorio permite la selección de la longitud de onda deseada. Los lectores de microplacas basados en filtros y en monocromadores tienen cada uno sus ventajas.

Los instrumentos basados en filtros utilizan componentes menos caros debido a su diseño más sencillo (en comparación con un monocromador). Los filtros específicos permiten que sean mínimas la pérdida de señal y la separación efectiva de las longitudes de onda de excitación y emisión, lo que los hace más sensibles a algunas aplicaciones. Probablemente necesitará un inventario inicial de filtros de uso común y adquirir filtros adicionales con el tiempo para adaptarse a las nuevas necesidades. Las aplicaciones como BRET, polarización de fluorescencia y TR-FRET normalmente requieren filtros para lograr la sensibilidad necesaria. Por otro lado, los instrumentos basados en monocromadores son muy cómodos y flexibles, cumplen los requisitos de sensibilidad de muchas aplicaciones y no requieren que mantenga un inventario de filtros específicos de la aplicación. Los monocromadores también ofrecen una función de barrido espectral para la caracterización de nuevos colorantes y el estudio de cambios espectrales.

¿Cuál debe elegir? Si trabaja siempre con la misma aplicación o las mismas longitudes de onda, el instrumento basado en filtros puede resultarle más barato. En general, los filtros proporcionan mayor sensibilidad que un monocromador en un instrumento comparable. Sin embargo, la sensibilidad que proporciona los monocromadores es suficiente para la mayoría de los ensayos, tienen más flexibilidad y son más cómodos que los instrumentos basados en filtros. Afortunadamente, los lectores SpectraMax i3x e iD5 de Molecular Devices ofrecen lo mejor de ambos mundos. Estos sistemas son híbridos que le permiten elegir entre filtros o monocromadores para obtener el mejor rendimiento para su ensayo.

¿Necesito un ancho de banda amplio o estrecho?

Un ancho de banda estrecho mejora la resolución y se recomienda para hacer mediciones de fluorescencia cuando los picos de excitación y emisión del fluoróforo están muy próximos (desplazamiento de Stokes estrecho). Minimiza la cantidad de medición de luz no deseada de modo que los niveles de fondo se reducen y la señal se mide con más especificidad.

Aumentar el ancho de banda permite que entre más luz por la trayectoria óptica del instrumento, lo que puede mejorar la relación señal-ruido y la sensibilidad. Un ancho de banda más amplio para la excitación aumenta la cantidad de luz que excita la muestra, mientras que para la emisión captura un rango más amplio de la señal de emisión.

El ancho de banda espectral que elija para su lector de microplacas dependerá de muchas cosas. ¿Qué aplicaciones realiza? ¿Realiza lecturas dobles, como por ejemplo FRET o TR-FRET (p. ej., HTRF®)? ¿Qué fluoróforos usa y cuáles son las formas de los picos de excitación y emisión? ¿Cuánto fondo tiene su ensayo? Como regla general, los anchos de banda estrechos son mejores para fluoróforos con un desplazamiento de Stokes pequeño y para hacer múltiples mediciones de fluorescencia a longitudes de onda que están muy próximas. Los anchos de banda más amplios son mejores para picos de excitación y emisión anchos porque aumentarán la sensibilidad de un ensayo. Sin embargo, debe ser cuidadoso a la hora de monitorizar el fondo de su ensayo, ya que los anchos de banda más amplios pueden hacer que se detecte una mayor fluorescencia de fondo, reduciendo la relación señal-ruido.

Afortunadamente, Molecular Devices ofrece un sistema con ancho de banda variable que puede ser específico y sensible al mismo tiempo y es adecuado para la optimización del ensayo, así que no tiene que elegir. El lector SpectraMax i3x tiene un ancho de banda variable para fluorescencia y luminiscencia, y usted puede elegir 9 nm o 15 nm para la excitación y 15 nm o 25 nm para la emisión. En el modo luminiscencia, si especifica una longitud de onda para la lectura, puede seleccionar un ancho de banda de emisión de 15 nm o 25 nm.

¿Necesito inyectores?

Necesitará inyectores si realiza ensayos de cinética rápida, como un ensayo de luciferasa doble o de calcio con fluorescencia (GPCR). Los ensayos de cinética rápida se caracterizan por una respuesta muy rápida tras la adición de un compuesto u otro reactivo a un pocillo. La velocidad de la respuesta, así como la rápida disminución de la señal resultante, significa que el instrumento utilizado para procesar estos ensayos tiene que leer un pocillo mientras se está añadiendo el reactivo, o muy poco después, de modo que se capture toda la señal.

¿Necesito un instrumento de lectura de la parte superior o del fondo del pocillo?

Si realiza únicamente experimentos en los que el material del ensayo se distribuye uniformemente por todo el pocillo (homogéneo), la lectura de la parte superior del pocillo será suficiente para usted. Sin embargo, si pretende procesar experimentos con células en los que la señal relevante se localiza en el fondo de los pocillos y puede incluso estar enmascarada en la parte superior por desactivadores o colorantes, entonces necesitará un lector de microplacas de lectura del fondo del pocillo.