Fluorescencia
¿Qué es la fluorescencia?
La fluorescencia es la propiedad de algunos átomos y moléculas de absorber luz a una longitud de onda determinada (la excitación: Ex) seguido por la emisión (Em) de luz de corta duración a una longitud de onda más larga (figura 2). La distancia entre los picos de excitación y de emisión se conoce como desplazamiento de Stokes y depende del fluoróforo (figura 1).
La fluorescencia implica una fuente de luz externa para excitar la muestra a una longitud de onda en particular. Cuando se excita a la longitud de onda adecuada, la molécula pasa de un estado básico a otro excitado. A medida que la molécula vuelve al estado fundamental, se libera energía en forma de calor (pérdida de energía) y luz a una longitud de onda diferente de menor energía (figura 3).
Figura 1
Figura 2
Figura 3
¿Cómo funciona la detección de fluorescencia?
Un lector de microplacas con detección de intensidad de fluorescencia (IF) emplea una fuente de luz, normalmente una lámpara de flash de xenón o una luz LED, para excitar un fluoróforo (molécula fluorescente) a una longitud de onda determinada. La longitud de onda necesaria para excitar la muestra se puede seleccionar mediante un filtro de una longitud de onda específica o un monocromador adaptado a la longitud de onda deseada.
A continuación, el fluoróforo emite luz de una longitud de onda diferente, seleccionada por un segundo filtro o monocromador. Un tubo fotomultiplicador (photomultiplier tube, PMT) detecta la fluorescencia emitida, y la intensidad de fluorescencia de la muestra se expresa en forma de unidades relativas de fluorescencia.