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Fluorescencia

¿Qué es la fluorescencia?

La fluorescencia es la propiedad de algunos átomos y moléculas de absorber luz a una longitud de onda determinada (la excitación: Ex) seguido por la emisión (Em) de luz de corta duración a una longitud de onda más larga (figura 2). La distancia entre los picos de excitación y de emisión se conoce como desplazamiento de Stokes y depende del fluoróforo (figura 1).

La fluorescencia implica una fuente de luz externa para excitar la muestra a una longitud de onda en particular. Cuando se excita a la longitud de onda adecuada, la molécula pasa de un estado básico a otro excitado. A medida que la molécula vuelve al estado fundamental, se libera energía en forma de calor (pérdida de energía) y luz a una longitud de onda diferente de menor energía (figura 3).

 

Dependiente del fluoróforo y desplazamiento de Stokes

 

Figura 1

Excitación y emisión de corta duración

 

Figura 2

Longitud de onda de menor energía

 

Figura 3

¿Cómo funciona la detección de fluorescencia?

Un lector de microplacas con detección de intensidad de fluorescencia (IF) emplea una fuente de luz, normalmente una lámpara de flash de xenón o una luz LED, para excitar un fluoróforo (molécula fluorescente) a una longitud de onda determinada. La longitud de onda necesaria para excitar la muestra se puede seleccionar mediante un filtro de una longitud de onda específica o un monocromador adaptado a la longitud de onda deseada.

A continuación, el fluoróforo emite luz de una longitud de onda diferente, seleccionada por un segundo filtro o monocromador. Un tubo fotomultiplicador (photomultiplier tube, PMT) detecta la fluorescencia emitida, y la intensidad de fluorescencia de la muestra se expresa en forma de unidades relativas de fluorescencia.

 

  • Fluorímetro frente a espectrofluorímetro frente a lector de placas de fluorescencia

    Fluorímetro frente a espectrofluorímetro

    Existen muchos términos que hacen referencia a instrumentos utilizados para medir la fluorescencia de una muestra: fluorímetro, espectrofluorímetro, espectrofotómetro de fluorescencia, espectrómetro de fluorescencia, fluorómetro, etc. 

    En general, utilizan una fuente de luz para excitar la muestra a una determinada longitud de onda y miden la fluorescencia emitida a una segunda longitud de onda. La muestra puede mantenerse en muchos formatos, como cubetas, capilares y placas de Petri. “Lector de microplacas de fluorescencia” hace referencia a un instrumento que puede medir la fluorescencia de la muestra en una microplaca, frecuentemente en una placa de 96 o 384 pocillos. Las microplacas ofrecen un rendimiento mayor y son útiles para el cribado u otras aplicaciones en las que se tienen que analizar muchas muestras.

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    ¿Qué es un sistema de espectrofluorimetría con doble monocromador?

    Sistema de espectrofluorimetría con doble monocromador

    Algunos lectores de microplacas de fluorescencia utilizan dobles monocromadores en lugar de filtros para seleccionar la longitud de onda de la luz que excita la muestra, así como la longitud de onda que emite la muestra. Los monocromadores utilizan una rejilla de difracción para separar espacialmente los colores de la luz y pueden seleccionar una amplia variedad de longitudes de onda sin necesidad de instalar un filtro independiente para cada longitud de onda necesaria para una aplicación.

    Nuestro espectrofluorímetro con doble monocromador SpectraMax Gemini utiliza dos monocromadores de barrido para la selección de las longitudes de onda óptimas de excitación y emisión.

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  • Ensayos de calcio (GPCR)

    Ensayos de calcio (GPCR)

    La señalización celular a través de receptores acoplados a proteína G (GPCR) se puede evaluar monitorizando los efectores posteriores, el calcio y el AMP cíclico (cAMP). El flujo de calcio en respuesta a la activación de receptores acoplados a proteína Gq normalmente se monitoriza en células vivas en tiempo real utilizando colorantes sensibles al calcio en un lector de placas de fluorescencia.

    Aquí encontrará algunas notas de aplicación sobre los ensayos de calcio (GPCR) que le pueden resultar interesantes:

    Ensayos de cAMP (GPCR)

    Ensayos de cAMP (GPCR)

    La monitorización de los niveles de cAMP, un segundo mensajero producido en respuesta a la activación de la adenilato ciclasa, es una de las formas más frecuentes de realizar cribados de agonistas y antagonistas de receptores acoplados a proteína Gi/Gs. Los niveles de cAMP se pueden monitorizar usando moléculas fluorescentes que se unen al cAMP y que se detectan usando un lector de placas de fluorescencia.

    Aquí encontrará algunas notas de aplicación sobre los ensayos de cAMP (GPCR) que le pueden resultar interesantes:

  • Ensayos de apoptosis para caspasa-3

    Ensayos de apoptosis para caspasa-3

    La apoptosis es un proceso celular muy regulado que causa la muerte de la célula en procesos normales como el desarrollo embrionario, así como en procesos patológicos como el cáncer y enfermedades neurodegenerativas. Los ensayos de apoptosis se pueden realizar usando diferentes sistemas de adquisición de imágenes o detección en lectores de microplacas y proporcionan información valiosa sobre los mecanismos fisiológicos y patológicos de la muerte celular.

    Descubra el ensayo homogéneo de caspasa-3 de un solo paso diseñado específicamente para los lectores de microplacas:

    Ensayos de proliferación celular

    Ensayos de proliferación celular

    La cuantificación de la proliferación celular con fluorescencia permite monitorizar fácilmente los efectos de fármacos y otros tratamientos experimentales sobre el crecimiento celular.

    En esta nota de aplicación se describen dos métodos de ensayo de proliferación celular. En el primero se cuantifica la proliferación celular utilizando una curva patrón con células. En el segundo se cuantifica la proliferación celular usando muestras tratadas con ARNasa y una curva patrón de ADN.

  • Ensayos de citotoxicidad

    Ensayos de citotoxicidad

    El desarrollo de ensayos in vitro predictivos adecuados para el análisis de la seguridad y eficacia es de gran interés para mejorar el proceso de desarrollo de fármacos y reducir la tasa de desestimación de fármacos. El uso de células madre ha suscitado mucho interés como herramienta para el cribado de compuestos durante las primeras fases del desarrollo de fármacos.

    En este póster científico presentamos los resultados obtenidos con uno de nuestros lectores de placas multimodo durante la realización de ensayos de toxicidad de diferentes compuestos usando modelos de células derivadas de células madre con un diseño de alto rendimiento:

    Ensayo EarlyTox Cardiotoxicity

    Ensayo EarlyTox Cardiotoxicity

    Los cardiomiocitos humanos derivados de células madre tienen características fenotípicas y perfiles electrofisiológicos similares a los de las células cardíacas humanas nativas. Los cardiomiocitos en cultivo pueden formar un sincitio pulsátil que se comporta de forma similar a los cardiomiocitos nativos. La oscilación de los niveles de calcio intracelular que se produce con las contracciones sincronizadas de las células se pueden monitorizar usando un colorante sensible al calcio, y los cambios inducidos por un tratamiento en el patrón de oscilación se pueden monitorizar a través de los cambios en la señal fluorescente a lo largo del tiempo.

    Aquí encontrará una nota de aplicación que le puede resultar interesante:

  • Kits de ensayo de viabilidad celular EarlyTox

    Kits de ensayo de viabilidad celular EarlyTox

    Los ensayos de viabilidad celular son fundamentales para un amplio espectro de áreas de investigación que abarcan desde la investigación de los mecanismos de muerte celular al desarrollo de nuevos tratamientos dirigidos a la apoptosis en enfermedades. Una de las tecnologías de detección más populares para medir la viabilidad celular es un lector de microplacas de fluorescencia.

    Aquí encontrará algunas aplicaciones que le pueden resultar interesantes:

    Cuantificación de proteínas fluorescentes

    Cuantificación de proteínas fluorescentes

    Las proteínas de las células eucariotas están en un estado dinámico, en un equilibrio muy regulado entre la síntesis y la degradación. Mientras que la síntesis de proteínas se conoce bien tras décadas de estudio, solo en las últimas dos décadas se han hecho avances importantes en el conocimiento que tenemos de la degradación de proteínas.

    Más información sobre proteínas fluorescentes en nuestro nota de aplicación:

  • Análisis de nanopartículas

    Análisis de nanopartículas

    La nanotecnología es un campo en rápido desarrollo que ha captado el interés de la comunidad científica gracias a sus posibles aplicaciones en investigación biomédica.

    Actualmente existe un número limitado de técnicas disponibles para caracterizar nanopartículas y sus interacciones moleculares. Aquí se describe el análisis de la firma espectral como método para confirmar las interacciones entre las nanopartículas y las moléculas que recubren la superficie.

    Flujo de calcio neuronal

    Flujo de calcio neuronal

    La monitorización de los cambios en el calcio intracelular es una técnica extremadamente útil para investigar las diferentes funciones que tienen los iones de calcio en el funcionamiento de las neuronas. La medición directa del flujo de calcio dinámico dentro de las redes neuronales revela cómo procesan las neuronas las señales procedentes del espacio extracelular.

    Esta nota de aplicación demuestra que es factible medir el flujo de calcio intracelular en neuronas corticales primarias de rata en un formato de microplaca con fluorescencia:

  • Cuantificación de ácidos nucleicos

    Cuantificación de ácidos nucleicos

    La cuantificación del ADN es una etapa crítica en biología molecular que requiere exactitud, fiabilidad y el uso de volúmenes cada vez más pequeños para aplicaciones como la secuenciación de última generación. En comparación con la cuantificación espectrofotométrica del ADN, el método fluorométrico proporciona ventajas clave como una sensibilidad significativamente mayor, alta selectividad por el ADN bicatenario (ADNbc) por encima del ADN monocatenario (ADNmc) o del ARN y mayor tolerancia a contaminantes (proteínas e hidratos de carbono).

    Aquí encontrará algunas notas de aplicación sobre la cuantificación de ácidos nucleicos que le pueden resultar interesantes:

    Detección de triptófano

    Detección de triptófano

    La fluorescencia intrínseca de las proteínas se debe a los aminoácidos aromáticos triptófano, tirosina y fenilalanina. La emisión del triptófano es predominante en las proteínas y es el más sensible a la polaridad de los solventes y al entorno local. El análisis de los cambios en la fluorescencia del triptófano puede proporcionar información sobre la desnaturalización y conformación de las proteínas.

    En estas notas de aplicación demostramos el rendimiento de los lectores de microplacas multimodo SpectraMax® para ensayos que miden la fluorescencia intrínseca del triptófano.

Recursos más recientes

Recursos de fluorescencia