¿Qué es la inmunotransferencia?
La inmunotransferencia es una técnica popular utilizada para la detección y cuantificación de proteínas. Permite separar e identificar una proteína de interés específica a partir de una mezcla compleja de proteínas, por ejemplo, un lisado celular. La inmunotransferencia tiene aplicaciones en ámbitos como el diagnóstico, la biotecnología, la biología molecular o la proteómica, entre otros, y se usa mucho para evaluar los niveles de expresión proteica en las células, así como los cambios en el tamaño y otras propiedades.
Métodos de inmunotransferencia
Existen varios métodos de inmunotransferencia que se pueden considerar en función del anticuerpo secundario que se utilice; la detección de la proteína diana puede ser colorimétrica, quimioluminiscente o fluorescente. Estos métodos se describen a continuación y requieren diferentes equipos para su detección. La quimioluminiscencia, por ejemplo, puede detectarse usando placas radiográficas o equipos de adquisición de imágenes digitales, mientras que para un anticuerpo secundario fluorescente se necesita un generador de imágenes de fluorescencia. Cada tipo de detección tiene ventajas e inconvenientes que deben ponderarse a la hora de seleccionar un método.
Otro método que hemos introducido, el sistema de detección ScanLater™ Western Blot, permite una novedosa detección de inmunotransferencias en una plataforma de lector de microplacas multimodo. Utilizando este ensayo sin sustrato, los investigadores pueden conseguir una sensibilidad equivalente a la de los ensayos con quimioluminiscencia tradicionales, consolidando al mismo tiempo las aplicaciones de inmunotransferencia, ELISA y otras aplicaciones en un único lector. A continuación, se proporciona información más detallada en nuestras notas de aplicación destacadas.
El sistema de detección ScanLater™ Western Blot permite la detección de inmunotransferencias en el lector de microplacas
Flujo de trabajo del ensayo de inmunotransferencia
Estos son los pasos para un ensayo de inmunotransferencia típico:
1. Realizar la electroforesis – En primer lugar se separan las proteínas por tamaño mediante electroforesis en gel.
2. Transferir – A continuación, se transfieren a una membrana de transferencia, normalmente de nitrocelulosa o PVDF, que se incubará con un anticuerpo primario específico de la proteína de interés.
3. Bloquear con tampón de bloqueo – Esto evita la unión del anticuerpo primario (del paso anterior) a la propia membrana.
4. Incubar con el anticuerpo primario – El anticuerpo primario se une a la proteína diana.
5. Lavar con tampón de lavado – El anticuerpo primario no unido se elimina mediante lavado.
6. Incubar con el anticuerpo secundario – Se añade un anticuerpo secundario que reconoce y se une al anticuerpo primario. Este anticuerpo secundario está conjugado con una enzima u otro material que permite la detección de la proteína de interés, la cual aparecerá como una banda en la transferencia.
7. Lavar con tampón de lavado – El anticuerpo secundario no unido se elimina mediante lavado.
8. Detectar usando el método/química de elección – La proteína diana se puede detectar mediante métodos colorimétricos, fluorescentes o quimioluminiscentes, dependiendo del anticuerpo secundario utilizado.
Descripción general de la inmunotransferencia
Aplicaciones de inmunotransferencia
- Detección y cuantificación de proteínas con el sistema de detección de inmunotransferencia ScanLater
- Valide células editadas con CRISPR utilizando la adquisición de imágenes y detección de inmunotransferencia
- Desde pocillos a inmunotransferencias: Estudio de la respuesta celular de proteínas de choque térmico
- Estimación de los pesos moleculares de proteínas con los marcadores de peso molecular ScanLater Western Blot
- Detección de proteínas basada en proteínas marcadas con europio
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Inmunotransferencia colorimétrica
Un método de inmunotransferencia colorimétrico utiliza un anticuerpo secundario conjugado con una enzima y un sustrato cromogénico para su detección.
Ventajas:
- No requiere un equipo especial
Desventajas:
- La sensibilidad es limitada (del orden de pg)
- Las membranas de transferencia no se pueden reutilizar para estudiar otras proteínas de interés
Inmunotransferencia colorimétrica
Un método de inmunotransferencia colorimétrico utiliza un anticuerpo secundario conjugado con una enzima y un sustrato cromogénico para su detección.
Ventajas:
- No requiere un equipo especial
Desventajas:
- La sensibilidad es limitada (del orden de pg)
- Las membranas de transferencia no se pueden reutilizar para estudiar otras proteínas de interés
Inmunotransferencia quimioluminiscente
En una inmunotransferencia quimioluminiscente se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con una enzima y un sustrato luminiscente. Los resultados se detectan con una placa radiográfica y equipo en cuarto oscuro, o un sistema de adquisición de imágenes digitales.
Ventajas:
- Sensibilidad (del orden de fg)
- Las membranas de transferencia se pueden limpiar y volver a incubar con otro anticuerpo primario
Desventajas:
- Los resultados pueden no ser lineales
- La señal es de corta duración
- El equipo necesario para la detección puede ser caro y ocupar mucho espacio
Inmunotransferencia quimioluminiscente
En una inmunotransferencia quimioluminiscente se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con una enzima y un sustrato luminiscente. Los resultados se detectan con una placa radiográfica y equipo en cuarto oscuro, o un sistema de adquisición de imágenes digitales.
Ventajas:
- Sensibilidad (del orden de fg)
- Las membranas de transferencia se pueden limpiar y volver a incubar con otro anticuerpo primario
Desventajas:
- Los resultados pueden no ser lineales
- La señal es de corta duración
- El equipo necesario para la detección puede ser caro y ocupar mucho espacio
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Inmunotransferencia fluorescente
En una inmunotransferencia fluorescente se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo, por lo que no se requiere sustrato. Se necesita un generador de imágenes de fluorescencia para detectar los resultados.
Ventajas:
- Mayor rango dinámico y mejor linealidad que los métodos colorimétricos o luminiscentes
- Admite el multiplexado con fluoróforos diferentes
Desventajas:
- Puede ser menos sensible que la quimioluminiscencia
- Requiere un sistema de adquisición de imágenes de fluorescencia específico
Inmunotransferencia fluorescente
En una inmunotransferencia fluorescente se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo, por lo que no se requiere sustrato. Se necesita un generador de imágenes de fluorescencia para detectar los resultados.
Ventajas:
- Mayor rango dinámico y mejor linealidad que los métodos colorimétricos o luminiscentes
- Admite el multiplexado con fluoróforos diferentes
Desventajas:
- Puede ser menos sensible que la quimioluminiscencia
- Requiere un sistema de adquisición de imágenes de fluorescencia específico
Sistema de detección de inmunotransferencia ScanLater
Con el sistema de detección ScanLater™ Western Blot, el anticuerpo secundario se conjuga con un fluoróforo resuelto en el tiempo que combina las ventajas de ambos métodos, fluorescente y quimioluminiscente.
- No se requiere sustrato para la detección
- Estabilidad de la señal de meses o más
- Sensibilidad del orden de subpicogramos
- Amplio rango dinámico
Sistema de detección de inmunotransferencia ScanLater
Con el sistema de detección ScanLater™ Western Blot, el anticuerpo secundario se conjuga con un fluoróforo resuelto en el tiempo que combina las ventajas de ambos métodos, fluorescente y quimioluminiscente.
- No se requiere sustrato para la detección
- Estabilidad de la señal de meses o más
- Sensibilidad del orden de subpicogramos
- Amplio rango dinámico
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Detección y cuantificación de proteínas con el sistema de detección de inmunotransferencia ScanLater
La detección de proteínas es importante hoy en día para la investigación farmacéutica y clínica, estando las inmunotransferencias entre los métodos empleados con más frecuencia para ese fin. Se utilizan diferentes técnicas para detectar proteínas en membranas de inmunotransferencia, incluidos métodos de fluorescencia y de quimioluminiscencia. Sin embargo, cada técnica tiene sus limitaciones y existe una necesidad continua de mejorar la cuantificación, exactitud y rango dinámico.
En esta nota de aplicación se muestra el mayor rango dinámico gracias al fondo reducido, así como la estabilidad de detección a lo largo del tiempo y el número de lecturas. Además, una comparación del sistema Scanlater Western Blot con un método de quimioluminiscencia demostró una mejor sensibilidad.
Detección y cuantificación de proteínas con el sistema de detección de inmunotransferencia ScanLater
La detección de proteínas es importante hoy en día para la investigación farmacéutica y clínica, estando las inmunotransferencias entre los métodos empleados con más frecuencia para ese fin. Se utilizan diferentes técnicas para detectar proteínas en membranas de inmunotransferencia, incluidos métodos de fluorescencia y de quimioluminiscencia. Sin embargo, cada técnica tiene sus limitaciones y existe una necesidad continua de mejorar la cuantificación, exactitud y rango dinámico.
En esta nota de aplicación se muestra el mayor rango dinámico gracias al fondo reducido, así como la estabilidad de detección a lo largo del tiempo y el número de lecturas. Además, una comparación del sistema Scanlater Western Blot con un método de quimioluminiscencia demostró una mejor sensibilidad.
Valide células editadas con CRISPR utilizando la adquisición de imágenes y detección de inmunotransferencia
La edición del genoma se ha utilizado ampliamente para estudiar la expresión génica y la función de proteínas, pero muchos de estos métodos son muy laboriosos e inexactos1. El sistema CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente interespaciadas)/Cas9 se ha convertido en una herramienta muy popular para la edición génica gracias a su elevada exactitud y facilidad de uso2.
Aquí demostramos cómo se pueden utilizar el lector de microplacas multimodo SpectraMax i3x y el sistema de detección ScanLater Western Blot para validar la edición génica CRISPR/Cas9.
Valide células editadas con CRISPR utilizando la adquisición de imágenes y detección de inmunotransferencia
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Desde pocillos a inmunotransferencias: Estudio de la respuesta celular de proteínas de choque térmico
El estudio de la respuesta celular puede implicar múltiples técnicas para obtener la información, como adquisición de imágenes, ensayos de viabilidad y proliferación con células, inmunotransferencias para buscar cambios en la expresión proteica, y más. A menudo se necesitan varias plataformas de instrumentos para obtener los resultados necesarios, y es posible que sea necesario conocer varios paquetes de software en el proceso.
En esta nota de aplicación mostramos cómo se obtuvieron varios parámetros celulares relacionados usando un único instrumento, la plataforma de detección multimodo SpectraMax® i3.
Desde pocillos a inmunotransferencias: Estudio de la respuesta celular de proteínas de choque térmico
El estudio de la respuesta celular puede implicar múltiples técnicas para obtener la información, como adquisición de imágenes, ensayos de viabilidad y proliferación con células, inmunotransferencias para buscar cambios en la expresión proteica, y más. A menudo se necesitan varias plataformas de instrumentos para obtener los resultados necesarios, y es posible que sea necesario conocer varios paquetes de software en el proceso.
En esta nota de aplicación mostramos cómo se obtuvieron varios parámetros celulares relacionados usando un único instrumento, la plataforma de detección multimodo SpectraMax® i3.
Estimación de los pesos moleculares de proteínas con los marcadores de peso molecular ScanLater Western Blot
Los marcadores de peso molecular ScanLater™ Western Blot son un componente esencial del sistema de detección ScanLater™ Western Blot. Las principales aplicaciones de estos marcadores de peso molecular son la estimación del peso molecular de las proteínas, la visualización de la electroforesis en gel y la evaluación del proceso de transferencia del gel a la membrana de transferencia.
Descubra cómo los usuarios pueden seguir el flujo de trabajo de electroforesis y transferencia que se ha optimizado para su aplicación.
Estimación de los pesos moleculares de proteínas con los marcadores de peso molecular ScanLater Western Blot
Los marcadores de peso molecular ScanLater™ Western Blot son un componente esencial del sistema de detección ScanLater™ Western Blot. Las principales aplicaciones de estos marcadores de peso molecular son la estimación del peso molecular de las proteínas, la visualización de la electroforesis en gel y la evaluación del proceso de transferencia del gel a la membrana de transferencia.
Descubra cómo los usuarios pueden seguir el flujo de trabajo de electroforesis y transferencia que se ha optimizado para su aplicación.
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Detección de proteínas basada en proteínas marcadas con europio
Detección y cuantificación de proteínas mediante inmunotransferencia basado en proteínas marcadas con europio usando un lector de placas.
Aquí describimos un nuevo sistema de análisis de inmunotransferencia incorporado en un lector de microplacas multimodo SpectraMax®. Las membranas se incuban con estreptavidina o con anticuerpos secundarios marcados con europio que marcan la proteína de interés. El europio (Eu) tiene una fluorescencia de larga duración, del orden de 1 ms, y la detección se realiza con el modo de detección de fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) que reduce significativamente el fondo debido a la autofluorescencia o a otras fuentes de emisiones de corta duración.
Detección de proteínas basada en proteínas marcadas con europio
Detección y cuantificación de proteínas mediante inmunotransferencia basado en proteínas marcadas con europio usando un lector de placas.
Aquí describimos un nuevo sistema de análisis de inmunotransferencia incorporado en un lector de microplacas multimodo SpectraMax®. Las membranas se incuban con estreptavidina o con anticuerpos secundarios marcados con europio que marcan la proteína de interés. El europio (Eu) tiene una fluorescencia de larga duración, del orden de 1 ms, y la detección se realiza con el modo de detección de fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) que reduce significativamente el fondo debido a la autofluorescencia o a otras fuentes de emisiones de corta duración.
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Sistema de detección de inmunotransferencia ScanLater
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