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Los investigadores obtienen nueva información sobre la respuesta inmunitaria durante infecciones respiratorias pediátricas usando el sistema ImageXpress Pico

“El sistema ImageXpress Pico permitió a nuestro equipo evaluar con exactitud y eficacia las características de unión de los mastocitos a los fibroblastos de pulmón humano infectados con VRS y entender mejor la respuesta inflamatoria frente al VRS”.

Seattle Children’s Hospital, Seattle Children’s Research

Institute, Universidad de Washington, Benaroya Research Institute

Autor principal: Dr. Stephen R. Reeves, investigador

principal en el Seattle Children’s Research Institute y

médico en el departamento de la División de Neumología y

Medicina del Sueño en el Seattle Children's Hospital

Sistema de adquisición automática de imágenes celulares ImageXpress Pico

El reto

Estudio de las características de unión de los mastocitos y el hialuronano de la matriz extracelular de fibroblastos de pulmón humano infectados con VRS

El virus respiratorio sincitial (VRS) es uno de los virus más comunes que infectan a niños de todo el mundo. Los casos leves del virus se limitan a la inflamación de las vías respiratorias altas (nariz y garganta); en los casos más graves se extiende a las vías respiratorias bajas (bronquios y pulmones) y van acompañados de tos, fiebre de bajo grado y pérdida del apetito.

El Dr. Reeves y sus colaboradores analizan la interacción entre células LUVA y la MEC de fibroblastos de pulmón humano (human lung fibroblasts, HLF).

Las infecciones más graves por el VRS pueden progresar a neumonía, insuficiencia respiratoria o incluso muerte. El VRS es muy contagioso y afecta predominantemente a niños. Sin embargo, también son susceptibles los adultos y personas con un sistema inmunológico debilitado. Los síntomas y la transmisión del VRS son similares a los de otros virus que afectan a las vías respiratorias altas y bajas, como la gripe A y B, rinovirus, adenovirus y la cepa de coronavirus de la COVID-19.

Entender mejor los mecanismos subyacentes de estos virus podría arrojar luz sobre las posibles opciones terapéuticas. Los investigadores del Seattle Children's Research Institute, de la Universidad de Washington, y el Benaroya Research Institute se propusieron estudiar uno de estos posibles mecanismos del VRS.

El Dr. Stephen Reeves y sus colaboradores diseñaron varios experimentos para determinar los efectos inflamatorios posteriores de las interacciones entre mastocitos y el hialuronano (HA) de los fibroblastos de pulmón humano (FPH) infectados con VRS. Se requería la adquisición de imágenes de fluorescencia tanto de células vivas como fijadas para analizar una serie de condiciones, como la localización y el mecanismo de acción del HA de la matriz extracelular (MEC), la expresión de proteínas en mastocitos y las interacciones moleculares entre el HA, los mastocitos y la MEC. La microscopía de fluorescencia tradicional requería el uso de cubreobjetos de vidrio para la adquisición de imágenes de células fijadas, lo que resultaba en un tiempo adicional de manipulación y procesamiento del tejido. El Dr. Reeves y su equipo necesitaban un sistema avanzado que pudiera capturar imágenes de gran calidad tanto de células vivas como de tejido fijado de una forma más eficiente.

La solución

Adquisición y análisis de imágenes de fluorescencia de células vivas y fijadas de alta resolución

El equipo de investigación eligió el sistema de adquisición automática de imágenes celulares ImageXpress® Pico por su facilidad de uso, flexibilidad y sus sólidas funciones analíticas.

Protocolos de ensayo
Para ayudar al equipo a poner en marcha sus experimentos rápidamente, nuestros científicos de aplicaciones de campo y especialistas de asistencia técnica proporcionaron formación y asistencia in situ para los diferentes ensayos. Esto incluía el desarrollo de protocolos de ensayo y análisis sobre la marcha de modo que las imágenes pudieran obtenerse y analizarse simultáneamente.

Adquisición de imágenes
El equipo de investigación realizó la adquisición de imágenes de células vivas y posteriormente fijaron el tejido para el estudio de los componentes de la matriz extracelular, que no se pueden visualizar fácilmente usando técnicas con células vivas. El sistema ImageXpress Pico permitió al equipo realizar toda la adquisición de imágenes usando placas multipocillo, reduciendo así significativamente el tiempo asociado a la manipulación y procesamiento de las muestras. Como parte de la adquisición de imágenes, se unieron áreas grandes de interés en objetivos de mayor aumento. Esto elimina la necesidad de replicados adicionales para su examen mediante microscopía de epifluorescencia tradicional y proporcionó imágenes de mayor calidad.

Análisis
El Dr. Reeves y sus colaboradores pudieron realizar un análisis cuantitativo de la interacción entre mastocitos (es decir, células LUVA) y la MEC de fibroblastos de pulmón humano (FPH) que estaban infectados con el virus respiratorio sincitial (VRS). Véanse a continuación las imágenes y los datos del análisis.

Células LUVA

El sistema ImageXpress Pico se utilizó también para analizar los efectos de los FPH infectados por VRS sobre la expresión de TSG-6 y la adhesión de mastocitos (es decir, células LUVA) durante un periodo de 48 horas.Véanse a continuación las imágenes y los datos del análisis. (Nota: TSG-6 es una proteína asociada a la inflamación y se ha demostrado que su expresión está incrementada en las células infectadas por el VRS).

Células infectadas por VRS

Los resultados

 

Los datos de gran calidad permiten lograr avances científicos más pronto

Utilizando el sistema ImageXpress Pico, el equipo del Dr. Reeves es el primero en demostrar que:

  • En los FPH de donantes pediátricos que están infectados con VRS, existe una mayor síntesis de HA, lo que tiene como consecuencia una matriz extracelular (MEC) enriquecida en HA.
  • Una MEC enriquecida con HA favorece una adhesión más fuerte de los mastocitos y aumenta la liberación de proteasas de mastocitos que contribuyen a una respuesta inflamatoria (p. ej., constricción de vías respiratorias, producción de mucosidad, tos).
  • Los FPH infectados con VRS muestran una mayor expresión de mediadores inflamatorios por parte de los mastocitos, así como una mayor adhesión de estas células.

Los resultados del estudio indican que la formación de una MEC rica en HA favorece un entorno proinflamatorio durante las infecciones víricas respiratorias agudas. Este mecanismo podría tener implicaciones de gran alcance para la intervención terapéutica para el VRS y otros virus respiratorios.

Infección de FPH con VRS

Resumen de los hallazgos: El estudio demuestra que la infección de los FPH con VRS induce la regulación por incremento de enzimas que sintetizan HA (HAS 2 y 3), mientras que las enzimas que degradan el HA (HYAL 2) se regulan por disminución, lo que conduce a una mayor acumulación de HA en la MEC y una mayor adherencia de los mastocitos. Asimismo, los FPH infectados con VRS muestran un incremento de la expresión de TSG-6, lo que favorece la unión de los mastocitos a la MEC. Los mastocitos unidos a la MEC inducida por el VRS aumentan la expresión de proteasas por parte de estas células, lo que contribuye al entorno proinflamatorio.

 

Referencias

 

Más información en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6997473/

“El sistema ImageXpress Pico está evolucionando constantemente para satisfacer nuestras necesidades en continuo cambio y está abriendo la puerta a nuevos descubrimientos. Estamos emocionados por ver lo que viene después”.

El Dr. Reeves y los demás autores forman parte del laboratorio del Dr. Jason Debley. En el Debley Lab utilizan métodos epidemiológicos, clínicos y moleculares para entender la evolución del asma en la primera infancia e investigar el papel del epitelio de las vías respiratorias en el asma infantil.

Los investigadores del Center for Immunity and Immunotherapies en el Seattle Children's Research Institute estudian algunas de las enfermedades infantiles más complejas que afectan al sistema inmunológico humano. Finalmente, el objetivo es utilizar el poder terapéutico de la inmunología para diseñar nuevos tratamientos.