El reto
Estudio de las características de unión de los mastocitos y el hialuronano de la matriz extracelular de fibroblastos de pulmón humano infectados con VRS
El virus respiratorio sincitial (VRS) es uno de los virus más comunes que infectan a niños de todo el mundo. Los casos leves del virus se limitan a la inflamación de las vías respiratorias altas (nariz y garganta); en los casos más graves se extiende a las vías respiratorias bajas (bronquios y pulmones) y van acompañados de tos, fiebre de bajo grado y pérdida del apetito.
Las infecciones más graves por el VRS pueden progresar a neumonía, insuficiencia respiratoria o incluso muerte. El VRS es muy contagioso y afecta predominantemente a niños. Sin embargo, también son susceptibles los adultos y personas con un sistema inmunológico debilitado. Los síntomas y la transmisión del VRS son similares a los de otros virus que afectan a las vías respiratorias altas y bajas, como la gripe A y B, rinovirus, adenovirus y la cepa de coronavirus de la COVID-19.
Entender mejor los mecanismos subyacentes de estos virus podría arrojar luz sobre las posibles opciones terapéuticas. Los investigadores del Seattle Children's Research Institute, de la Universidad de Washington, y el Benaroya Research Institute se propusieron estudiar uno de estos posibles mecanismos del VRS.
El Dr. Stephen Reeves y sus colaboradores diseñaron varios experimentos para determinar los efectos inflamatorios posteriores de las interacciones entre mastocitos y el hialuronano (HA) de los fibroblastos de pulmón humano (FPH) infectados con VRS. Se requería la adquisición de imágenes de fluorescencia tanto de células vivas como fijadas para analizar una serie de condiciones, como la localización y el mecanismo de acción del HA de la matriz extracelular (MEC), la expresión de proteínas en mastocitos y las interacciones moleculares entre el HA, los mastocitos y la MEC. La microscopía de fluorescencia tradicional requería el uso de cubreobjetos de vidrio para la adquisición de imágenes de células fijadas, lo que resultaba en un tiempo adicional de manipulación y procesamiento del tejido. El Dr. Reeves y su equipo necesitaban un sistema avanzado que pudiera capturar imágenes de gran calidad tanto de células vivas como de tejido fijado de una forma más eficiente.
La solución
Adquisición y análisis de imágenes de fluorescencia de células vivas y fijadas de alta resolución
El equipo de investigación eligió el sistema de adquisición automática de imágenes celulares ImageXpress® Pico por su facilidad de uso, flexibilidad y sus sólidas funciones analíticas.
Protocolos de ensayo
Para ayudar al equipo a poner en marcha sus experimentos rápidamente, nuestros científicos de aplicaciones de campo y especialistas de asistencia técnica proporcionaron formación y asistencia in situ para los diferentes ensayos. Esto incluía el desarrollo de protocolos de ensayo y análisis sobre la marcha de modo que las imágenes pudieran obtenerse y analizarse simultáneamente.
Adquisición de imágenes
El equipo de investigación realizó la adquisición de imágenes de células vivas y posteriormente fijaron el tejido para el estudio de los componentes de la matriz extracelular, que no se pueden visualizar fácilmente usando técnicas con células vivas. El sistema ImageXpress Pico permitió al equipo realizar toda la adquisición de imágenes usando placas multipocillo, reduciendo así significativamente el tiempo asociado a la manipulación y procesamiento de las muestras. Como parte de la adquisición de imágenes, se unieron áreas grandes de interés en objetivos de mayor aumento. Esto elimina la necesidad de replicados adicionales para su examen mediante microscopía de epifluorescencia tradicional y proporcionó imágenes de mayor calidad.
Análisis
El Dr. Reeves y sus colaboradores pudieron realizar un análisis cuantitativo de la interacción entre mastocitos (es decir, células LUVA) y la MEC de fibroblastos de pulmón humano (FPH) que estaban infectados con el virus respiratorio sincitial (VRS). Véanse a continuación las imágenes y los datos del análisis.
El sistema ImageXpress Pico se utilizó también para analizar los efectos de los FPH infectados por VRS sobre la expresión de TSG-6 y la adhesión de mastocitos (es decir, células LUVA) durante un periodo de 48 horas.Véanse a continuación las imágenes y los datos del análisis. (Nota: TSG-6 es una proteína asociada a la inflamación y se ha demostrado que su expresión está incrementada en las células infectadas por el VRS).
Sistema de adquisición automática de imágenes celulares ImageXpress Pico
Productos utilizados
El sistema ImageXpress Pico es un sistema de adquisición de imágenes celulares sólido y fiable que se adapta perfectamente a su mesa de laboratorio. Este asequible generador de imágenes está diseñado para laboratorios de biología individual o para aquellos que buscan aumentar de escala para aplicaciones de cribado de alto rendimiento. Combina la adquisición de imágenes de alta resolución con un análisis potente en un tamaño compacto para usuarios con todos los niveles de experiencia en estudios por imagen. El sistema cuenta con un catálogo completo de protocolos preconfigurados para ensayos con células, junto con funciones avanzadas como confocal digital. Independientemente de si está realizando ensayos de fluorescencia o campo brillante para células fijadas o vivas, el sistema ImageXpress Pico está diseñado para que comience a adquirir imágenes y generar datos con tan solo unos clics.
Los resultados
Los datos de gran calidad permiten lograr avances científicos más pronto
Utilizando el sistema ImageXpress Pico, el equipo del Dr. Reeves es el primero en demostrar que:
- En los FPH de donantes pediátricos que están infectados con VRS, existe una mayor síntesis de HA, lo que tiene como consecuencia una matriz extracelular (MEC) enriquecida en HA.
- Una MEC enriquecida con HA favorece una adhesión más fuerte de los mastocitos y aumenta la liberación de proteasas de mastocitos que contribuyen a una respuesta inflamatoria (p. ej., constricción de vías respiratorias, producción de mucosidad, tos).
- Los FPH infectados con VRS muestran una mayor expresión de mediadores inflamatorios por parte de los mastocitos, así como una mayor adhesión de estas células.
Los resultados del estudio indican que la formación de una MEC rica en HA favorece un entorno proinflamatorio durante las infecciones víricas respiratorias agudas. Este mecanismo podría tener implicaciones de gran alcance para la intervención terapéutica para el VRS y otros virus respiratorios.
Resumen de los hallazgos: El estudio demuestra que la infección de los FPH con VRS induce la regulación por incremento de enzimas que sintetizan HA (HAS 2 y 3), mientras que las enzimas que degradan el HA (HYAL 2) se regulan por disminución, lo que conduce a una mayor acumulación de HA en la MEC y una mayor adherencia de los mastocitos. Asimismo, los FPH infectados con VRS muestran un incremento de la expresión de TSG-6, lo que favorece la unión de los mastocitos a la MEC. Los mastocitos unidos a la MEC inducida por el VRS aumentan la expresión de proteasas por parte de estas células, lo que contribuye al entorno proinflamatorio.
Referencias
Más información en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6997473/
“El sistema ImageXpress Pico está evolucionando constantemente para satisfacer nuestras necesidades en continuo cambio y está abriendo la puerta a nuevos descubrimientos. Estamos emocionados por ver lo que viene después”.
El Dr. Reeves y los demás autores forman parte del laboratorio del Dr. Jason Debley. En el Debley Lab utilizan métodos epidemiológicos, clínicos y moleculares para entender la evolución del asma en la primera infancia e investigar el papel del epitelio de las vías respiratorias en el asma infantil.
Los investigadores del Center for Immunity and Immunotherapies en el Seattle Children's Research Institute estudian algunas de las enfermedades infantiles más complejas que afectan al sistema inmunológico humano. Finalmente, el objetivo es utilizar el poder terapéutico de la inmunología para diseñar nuevos tratamientos.