Producción de organoides a escala industrial: desafíos, ventajas y soluciones
La constatación de que las líneas celulares 2D carecen de la complejidad para representar los sistemas biológicos humanos animó a los científicos a buscar herramientas de cultivo in vitro más avanzadas para la investigación biomédica. Los avances recientes han llevado a la creación de modelos 3D como esferoides y organoides.
Los esferoides son generalmente agregados flotantes libres de múltiples tipos de células y es posible que tengan una baja complejidad en la organización de tumores reflejados. Por el contrario, los organoides se definen por su capacidad de autoensamblaje a partir de células madre diferenciadas en una disposición espacial que refleja el órgano corporal que representan, recapitulando la estructura y la función biológica del órgano, pero en una escala en miniatura. Por lo tanto, los organoides son un modelo fisiológicamente relevante para estudiar enfermedades humanas y evaluar la eficacia y la seguridad del fármaco; por ejemplo, los organoides imitan la respuesta del paciente cuando ambos se tratan con los mismos fármacos. Pueden producirse organoides que representan tejido enfermo o sano de la mayoría de los órganos del cuerpo.
Como resultado, los modelos de células organoides ofrecen la posibilidad de acelerar la planificación del desarrollo de fármacos, reduciendo la alta tasa de abandono en los ensayos clínicos y los costes asociados.
Sin embargo, para que esto se generalice y sea compatible con aplicaciones de cribado de alto rendimiento, se requiere la producción de organoides a escala.
Escalar la producción de organoides para garantizar la coherencia, la reproducibilidad y la relevancia estadística cuando las pruebas son difíciles. En este podcast, los expertos en organoides Victoria Marsh Durban , Director de Servicios de Organoides Personalizados en Molecular Devices y Magdalena Kasendra , Directora de Investigación y Desarrollo en el Centro de Medicina de Células Madres y Organoides del Cincinnati Children’s Hospital, analizan las ventajas y los desafíos de la producción de organoides a escala industrial.
Aspectos básicos de la producción de organoides
Los organoides suelen provenir de células madre pluripotentes o adultas.
Las células madre pluripotentes (PSC) pueden obtenerse de los fibroblastos cutáneos de los pacientes o de las células mononucleares de sangre periférica. Son autorrenovables y pueden reprogramarse para diferenciarse en múltiples tipos de células. Cuando se utilizan PSC, es necesario recapitular el desarrollo embrionario in vitro en un proceso complejo de múltiples pasos, que implica la aplicación de diferentes factores de crecimiento para generar características de múltiples linajes celulares. Esto induce la diferenciación en múltiples tipos de organoides (p. ej., cerebro, pulmón, corazón, riñón e hígado) de las mismas células originales, de ahí el término células madre pluripotentes inducidas (iPSC).
Ejemplos de modelos celulares 3D de la parte superior izquierda: organoides cerebrales, organoides pulmonares, cardioide (organoides cardíacos) y modelo hepático 3D.
Las células madre adultas, a partir de muestras de biopsia de pacientes o tejido resecado, tienen un mecanismo celular innato que las “forza” a diferenciarse en la ruta requerida para recrear el tejido del que se han originado. En otras palabras, pueden convertirse en organoides espontáneamente en el laboratorio cuando se cultivan en matrices extracelulares y teniendo en cuenta los factores de crecimiento específicos del tejido adecuados.
En general, la fabricación de organoides a partir de células madre adultas aisladas de biopsias de tejido de pacientes primarios es más sencilla que el uso de iPSC.
Desafíos relacionados con la producción de organoides
La investigación con organoides sigue siendo nueva y está creciendo, por lo que los científicos se enfrentan a desafíos en la optimización y la producción de organoides ampliada independientemente del tipo de células madre utilizadas como punto de partida.
Uno de los principales desafíos en el uso de organoides derivados de células madre adultas está relacionado con el proceso de cultivo celular que debe llevarse a cabo completamente en 3D utilizando hidrogel. Este proceso es mucho más exigente y lleva mucho tiempo que la cultura 2D.
Los flujos de trabajo basados en PSC conllevan complicaciones adicionales debido a la dificultad de manipularlos en los patrones de diferenciación deseados. Magdalena afirma: “Cuando utilizamos iPSC, necesitamos recapitular el desarrollo embrionario in vitro mediante la introducción de diferentes factores de crecimiento para imitar varios linajes celulares”. Afortunadamente, estas limitaciones se pueden superar hoy en día con el desarrollo de bioprocesos altamente automatizados de última generación.
Los biorreactores se han utilizado ampliamente en el cultivo de organoides (tanto iPSC como células madre adultas) en condiciones ambientales cuidadosamente supervisadas; sin embargo, se asocian desafíos adicionales con su uso. Específicamente, la transición del crecimiento inicial en matrices basadas en hidrogel a la suspensión en biorreactores requiere un gran cuidado.
Mientras están suspendidos en un hidrogel, los iPSC no están expuestos a ninguna estimulación mecánica. Sin embargo, colocarlos en una suspensión 3D los somete a una tensión de cizallamiento que cambia rápidamente, lo que puede afectar a la tasa de crecimiento y la diferenciación. Mientras que los bajos niveles de estrés de cizallamiento promueven la diferenciación, los niveles excesivos pueden inducir daño celular y la muerte. Por lo tanto, la tensión de cizallamiento del biorreactor debe optimizarse cuidadosamente para lograr los estados de diferenciación deseados sin perder el rendimiento organoide. Las estrategias actuales incluyen la regulación de la velocidad de rotación del biorreactor o el uso de un biorreactor sin tensión de cizallamiento. La estrategia óptima depende de los requisitos exactos de crecimiento y diferenciación para el organoide de interés y de garantizar que el hidrogel que transporta las células madre iniciales sea compatible con el biorreactor. Los hidrogeles blandos, por ejemplo, pueden descomponerse en biorreactores debido a la tensión de cizallamiento, lo que pone en peligro la integridad de los agregados de células madre.
Otro desafío es la dificultad de obtener el material de origen para las células madre adultas, es decir, encontrar una línea organoide original adecuada o material de biopsia del paciente primario. Actualmente, la mayoría de las investigaciones de organoides se realizan en instituciones de investigación afiliadas al mundo académico, donde los organoides se producen únicamente con fines de investigación sin fines de lucro. Sin embargo, la traducción del ámbito académico al entorno comercial, como las empresas farmacéuticas, planteará inevitablemente preocupaciones éticas. Se tendrá que tener en cuenta el consentimiento ético al comercializar cultivos de organoides a partir de muestras de pacientes.
Los organoides colorrectales pueden usarse para estudiar enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII).
La recreación de cultivos de organoides a partir de organoides originales también puede ser engorrosa debido a las variaciones entre diferentes protocolos de optimización de líneas celulares. Por ejemplo, el cultivo de organoides cerebrales (cerebro) implica la transferencia de IPCS a un medio de inducción neuronal antes de cultivarlos en gotas de hidrogel. Según Victoria, “los protocolos pueden variar significativamente dependiendo del tipo de tejido de origen, p. ej., si se trata de un tejido canceroso y del subtipo de tipo de cáncer al que pertenece. Por eso es posible que necesite optimizar el flujo de trabajo de producción línea por línea, lo que requiere un ojo experto”.
Un solo error en la implementación del protocolo puede empujar la línea celular para diferenciarla en un fenotipo no deseado.
Ventajas de aumentar los organoides
Aunque aumentar la producción de organoides puede resultar difícil, las recompensas pueden ser considerables.
Según Magdalena, una de las principales ventajas es la facilidad de traducción al panorama biofarmacéutico: “La ampliación hace que los organoides sean susceptibles a las normas del sector y a las prácticas reguladoras para que puedan emplearse más fácilmente en el descubrimiento de fármacos, la terapia con células madre y las aplicaciones de medicina personalizada”.
La producción por lotes a gran escala de organoides puede beneficiar tanto a la investigación académica como a la industrial. La fabricación de grandes lotes de organoides permite a científicos y fabricantes realizar experimentos más grandes con ensayos de alto rendimiento.
Victoria añade que los lotes de organoides grandes pueden mitigar la variabilidad entre lotes: “En particular, los reactivos de origen animal utilizados en la producción de organoides suelen proceder de diversas fuentes. Estos reactivos en crecimiento se derivan específicamente para experimentos a pequeña escala. Esto significa que cada vez que uno quiere cultivar organoides, va a utilizar un reactivo diferente, lo que apunta a una falta de estandarización de organoides”.
Por último, la implementación de biorreactores compatibles puede ayudar a los investigadores a supervisar las condiciones ambientales, como el estrés de cizallamiento, con mayor facilidad, mejorando en última instancia la consistencia y, por lo tanto, la reproducibilidad.
Organoides: La potencia predictiva del 3D
El mayor énfasis en la investigación de organoides se debe principalmente a que los organoides liberan una visión más profunda de la arquitectura tisular y las interacciones entre células, lo que aumenta la potencia predictiva en el proceso de descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, se han utilizado “miniintestinos” para identificar los fármacos más eficaces para pacientes con formas específicas de fibrosis quística (1). Modelos similares, desarrollados a partir de pacientes que padecen cáncer gastrointestinal, también demostraron predecir el impacto de los tratamientos en los propios pacientes (2). Más recientemente, se utilizó una amplia gama de tipos de organoides para modelar el impacto de la infección por SARS-CoV-2 en varios tejidos e identificar varios tratamientos (3).
Los organoides intestinales son modelos de microtejido 3D que recrean estructuras en la luz intestinal y en el epitelio intestinal circundante. Puede simular las funciones intestinales esenciales, como la absorción de nutrientes y la secreción de mucosidad.
Esta predictividad mejorada significa que los organoides pueden identificar los fracasos de los candidatos a fármacos en una fase más temprana del proceso de descubrimiento de fármacos y eliminar los falsos positivos (es decir, candidatos que fracasaron en entornos clínicos a pesar de su promesa en la investigación preclínica) mucho antes en el proceso.
Los organoides también son prometedores dentro de la medicina personalizada. Las células madre específicas del paciente dan lugar a organoides congruentes con la composición genética y las características fisiológicas del paciente. Por lo tanto, los organoides serán inestimables cuando se desarrollen tratamientos personalizados para personas con trastornos genéticos raros y cánceres resistentes al tratamiento.
El uso más generalizado de organoides también puede reducir el uso de modelos animales. Al igual que los modelos celulares 2D, los modelos animales también son inadecuados para predecir la respuesta del paciente, por lo que su amplio uso supone un riesgo de fracaso clínico. También existe la presión añadida de preocupaciones éticas sobre el uso de animales en el descubrimiento de fármacos. Con el establecimiento de la ley de modernización de la FDA, los investigadores han comenzado a buscar estrategias alternativas a los modelos animales.
El uso de organoides como plataforma in vitro para el desarrollo de fármacos y el estudio de los mecanismos de la enfermedad, junto con los cambios en la ley, nos permitirá reducir el número de animales utilizados en la investigación. La adopción de organoides ganará fuerza a medida que los científicos se den cuenta de su valor y adquieran las habilidades y la experiencia necesarias para usarlos en el laboratorio. El acceso a las líneas de organoides y el desarrollo de ensayos para aprovechar al máximo este complejo modelo in vitro centrado en el ser humano ampliará sustancialmente el campo de los organoides y nos llevará a una nueva era de investigación en ciencias de la vida.
- Saini, Angela. “Los pacientes con fibrosis quística se benefician de los miniintestinos”. Célula madre 19,4 (2016): 425-427.
- Vlachogiannis, Georgios, et al. “Modelo de organoides derivado del paciente para la respuesta al tratamiento de los cánceres gastrointestinales metastásicos”. Ciencia 359,6378 ( 2018): 920-926.
- Han, Yuling, et al. “Modelos organoides humanos para estudiar la infección por SARS-CoV-2”. Métodos naturales 19,4 (2022): 418-428.