Organoides
La investigación biológica y los modelos de enfermedades recrean la complejidad de los tejidos reales
¿Qué son los organoides?
Los organoides son microtejidos multicelulares tridimensionales (3D) derivados de células madre que se han diseñado para recrear fielmente la compleja estructura y funcionalidad de órganos humanos como el pulmón, el hígado o el cerebro. Los organoides son multicelulares y muestran un elevado orden de autoensamblaje que permite una representación incluso mejor de respuestas e interacciones celulares in vivo complejas, en comparación con los cultivos celulares 2D tradicionales.
Existen tres definiciones distintas que diferencian un organoide:
- Es un microtejido biológico 3D que contiene varios tipos de células.
- Representa la complejidad, organización y estructura de un tejido.
- Se asemeja al menos a algún aspecto de la funcionalidad de un tejido.
Los organoides están adquiriendo cada vez más importancia en los campos de la investigación del cáncer, la neurobiología, la investigación con células madre y el descubrimiento de fármacos, ya que permiten crear modelos mejorados de tejidos humanos. Los organoides, que se obtienen a partir de células madre, se pueden diferenciar en una gran variedad de tipos tisulares, como hígado, pulmón, cerebro, riñón, estómago e intestino. Puesto que estos microtejidos 3D recrean órganos in vivo, pueden proporcionar a los investigadores más información sobre los mecanismos de desarrollo y patológicos humanos. Por ejemplo, los investigadores pueden crecer los organoides a partir de células modificadas genéticamente para entender la vinculación de mutaciones génicas específicas con determinados trastornos genéticos. Los organoides también pueden facilitar el estudio de enfermedades infecciosas y de las interacciones huésped-patógeno. Por último, la posibilidad de usar organoides derivados de pacientes para cribados de fármacos y evaluaciones de la toxicidad permite a los investigadores hacer más avances en la medicina personalizada.
Flujo de trabajo general para el cultivo y cribado de organoides
Debido a la creciente complejidad de los organoides y otros sistemas celulares 3D, se necesitan técnicas más sofisticadas de adquisición y análisis de imágenes 3D para caracterizar con exactitud y eficiencia estos ensayos biológicos. Actualmente se utilizan con frecuencia sistemas automatizados de adquisición de imágenes confocales y software de análisis de imágenes 3D para ayudar a los investigadores a simplificar su flujo de trabajo y obtener resultados óptimos.
Paso 1) Precultivo 2D
Los organoides proceden de células primarias (es decir, intestino, pulmón o riñón) o de células madre pluripotentes inducidas. Las células madre tienen la capacidad de diferenciarse y autoensamblarse para formar diferentes organoides específicos de tejido.
Paso 2) Desarrollo de organoides 3D
Normalmente, las células se mezclan previamente con Matrigel y se colocan gotas en una placa de 24 pocillos a temperatura ambiente. A continuación, las placas se llevan a un incubador para que se forme una “cúpula” sólida de gotas. Posteriormente se añade medio durante siete días o más para favorecer el crecimiento celular y la diferenciación en tejidos específicos (cerebro, intestino, pulmón, etc.). Los medios contienen proteínas de la matriz extracelular y factores de crecimiento, que podrán variar dependiendo del tipo de tejido que se esté desarrollando.
Paso 3) Cultivo de organoides
El cultivo de organoides es un proceso largo y puede incluir varios pasos con diferentes medios. Durante este proceso es necesario monitorizar (por imagen) la salud de las células, que normalmente se emplean para comprender la biología del desarrollo y los tejidos.
Paso 4) Monitorización y lecturas
Antes de realizar experimentos, los organoides deben monitorizarse y caracterizarse para garantizar que cuentan con la diferenciación y la estructura tisular adecuada. La adquisición de imágenes de alto contenido permite monitorizar y visualizar el crecimiento y la diferenciación de los organoides, la reconstrucción 3D de las estructuras, el análisis complejo de la estructura, la morfología y viabilidad celular de los organoides, así como la expresión de diferentes marcadores celulares.
Paso 5) Adquisición de imágenes confocales y análisis 3D
La adquisición de imágenes confocales y el análisis 3D de los organoides permiten la visualización y cuantificación de los organoides y las células que forman el organoide. Se podría utilizar la caracterización de múltiples descriptores cuantitativos de organoides para estudiar fenotipos de enfermedades y los efectos de compuestos.
Adquisición de imágenes confocales y análisis de imágenes 3D de organoides
Los organoides son muy útiles para la creación de modelos de enfermedades y para la evaluación de los efectos de compuestos. La adquisición y análisis automáticos de imágenes de organoides son importantes para la evaluación cuantitativa de cambios fenotípicos en los organoides, así como para incrementar el rendimiento de los experimentos y los cribados.
La adquisición de imágenes confocales, como el sistema ImageXpress® Confocal HT.ai con láseres de alto rendimiento y objetivos de inmersión en agua son especialmente útiles para capturar la complejidad de los ensayos biológicos 3D. A diferencia de los esferoides típicos, que tienen la apariencia de objetos sólidos y una penetración limitada de la luz, algunos organoides 3D, como los organoides pulmonares, tienen una apariencia hueca, con lumen o cavidades interiores, por lo que la luz puede penetrar más fácilmente, lo que permite adquirir imágenes “a través” de los microtejidos embebidos en Matrigel.
Las herramientas de análisis de alto contenido, como el software de análisis de imágenes MetaXpress o IN Carta, permiten la búsqueda y caracterización de múltiples objetos u organoides, en formato 2D (para un plano único, o imágenes de proyección máxima) o en formato 3D cuando el software conecta y reconstruye los objetos de planos múltiples en el espacio 3D. En los organoides se puede caracterizar el diámetro, volumen, forma, intensidad de marcadores específicos o la distancia a otros objetos.
Además, se pueden definir y medir células individuales, núcleos u orgánulos dentro de cada organoide. Esto permite contar las células vivas y muertas, o las células con un marcador específico, definiendo también los volúmenes y distancias entre los objetos. Se pueden contabilizar valores numéricos para cada organoide o promediar por pocillo.
Galería de imágenes de células de organoides de pulmón
Análisis de imagen de organoide
Organoides de pulmón
Organoides de pulmón 2
La adquisición automática de imágenes de organoides vivos en Matrigel se realizó utilizando la opción confocal, aumento 4X y 10X
Organoide de pulmón de alta complejidad
Células de organoide de intestino con dTomato en rojo, detección de doble positivas (mNeon) en verde
Genes expresados internamente, dTomato magenta, mNeon verde, 10X
Organoide intestinal 40X, recuento celular dTomato
Organoide de pulmón 10X, 20X, varias tinciones Hoechst MitoTracker
Organoides de pulmón, proyección de imagen y panel con Z-stack; células vivas teñidas con Hoechst azul (núcleos), MitoTracker (rojo, mitocondrias) y calceína AM (verde, colorante de viabilidad); 20X inmersión en agua
Organoides de pulmón 3
Organoides de pulmón 4
Organoides de pulmón, células epiteliales de vías respiratorias cultivadas en cúpulas de Matrigel durante 8 semanas
Análisis de organoides, clasificación de células multiplexada
Análisis de organoides, clasificación de células multiplexada 2
Desarrollo de organoides