¿Qué es la absorbancia?
La absorbancia (A), también conocida como densidad óptica (DO), es la cantidad de luz absorbida por una solución. La transmitancia es la cantidad de luz que pasa a través de una solución. La absorbancia y el porcentaje de transmitancia se utilizan frecuentemente en espectrofotometría y se pueden expresar como sigue:
Ecuación de absorbancia
A = Log10 (I0/I)
donde I0 es la intensidad de la luz incidente e I es la intensidad de la luz después de pasar a través de la muestra
T = I/I0 y %T = 100 (T)
La ecuación que permite calcular la absorbancia a partir del porcentaje de transmitancia es
A = 2 - log10 (%T)
Determinación de la concentración usando la ley de Beer-Lambert
La concentración de una muestra se puede calcular a partir de su absorbancia mediante la ley de Beer-Lambert, que se expresa como sigue:
A = ε * c * p
Donde ε es la absortividad molar, o coeficiente de extinción molar, en L mol-1 cm-1
c es la concentración del soluto en disolución, en mol/L
p es la longitud de trayectoria de la muestra, en cm, por ejemplo 1 cm para una cubeta
Las mediciones de ultravioleta (UV) en microplacas se hicieron posibles cuando Molecular Devices introdujo el primer lector de microplacas con función UV. Desde entonces, las mediciones de ADN, ARN y proteínas en microplacas que esto permite se han hecho muy populares. Más información sobre cómo se mide la absorbancia y algunas aplicaciones clave que utilizan esta medida.
SEMINARIO WEB BAJO DEMANDA
Explorando las aplicaciones de ensayos basados en la absorbancia: desde la investigación de virus a la de cannabis
La lectura de la absorbancia con los lectores de microplacas SpectraMax® y el software SoftMax® Pro permite medir la densidad óptica de las muestras en formato de microplaca o cubeta. Las potentes herramientas de análisis del software generan una curva patrón y datos calculados. Para los laboratorios regulados según la BPF/BPL, los sistemas se suministran equipados con nuestro software de cumplimiento SoftMax Pro GxP.
Aspectos clave:
- ¿Cómo funciona la detección de absorbancia?
- Detección de inmunoglobulinas (Ig) con ELISA: más formas de investigar enfermedades infecciosas y respuestas inmunitarias
- Análisis optimizado de cerveza y vino mediante la medición de la absorbancia
- Determinación de la aflatoxina total en el cannabis usando un ELISA
Descripción general de la absorbancia
Definiciones de absorbancia
Aplicaciones de absorbancia
- Viabilidad celular, citotoxicidad, proliferación celular (MTT, XTT, MTS)
- Cuantificación de ADN/ARN
- Cinética enzimática, proliferación microbiana/bacteriana
- Ensayos de endotoxinas
- ELISA/inmunoensayos (cuantificación de antígenos, citoquinas, etc.)
- Aplicaciones con microvolúmenes
- Mediciones de densidad óptica usando la tecnología PathCheck
- Cuantificación de proteínas (ensayos de BCA, Bradford y Lowry)
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¿Cómo funciona la detección de absorbancia?
Los espectrofotómetros y los lectores de microplacas de absorbancia miden la cantidad de luz que absorbe una muestra. Los lectores de microplacas que detectan la luz en el rango del ultravioleta (UV) pueden utilizarse para determinar la concentración de ácidos nucleicos (ADN y ARN) o proteínas directamente, sin necesidad del marcaje de las muestras. A través de la muestra pasa luz de una longitud de onda determinada, que depende del material que se está midiendo, y un detector situado al otro lado del pocillo de la microplaca mide la cantidad de luz original absorbida por la muestra contenida en el pocillo.
¿Cómo funciona la detección de absorbancia?
Los espectrofotómetros y los lectores de microplacas de absorbancia miden la cantidad de luz que absorbe una muestra. Los lectores de microplacas que detectan la luz en el rango del ultravioleta (UV) pueden utilizarse para determinar la concentración de ácidos nucleicos (ADN y ARN) o proteínas directamente, sin necesidad del marcaje de las muestras. A través de la muestra pasa luz de una longitud de onda determinada, que depende del material que se está midiendo, y un detector situado al otro lado del pocillo de la microplaca mide la cantidad de luz original absorbida por la muestra contenida en el pocillo.
¿Dónde se mide la absorbancia?
La absorbancia se mide usando un espectrofotómetro o un lector de microplacas, que es un instrumento que dirige la luz de una longitud de onda específica a través de una muestra y mide la cantidad de luz que absorbe la muestra.
Espectrofotómetro frente al lector de placas
Un espectrofotómetro convencional mide la absorbancia de una muestra cada vez, normalmente colocada en una cubeta a través de la cual se hace pasar la luz horizontalmente. Un lector de placas de absorbancia ofrece un mayor rendimiento y puede medir la absorbancia de las muestras en microplacas, normalmente de 96 pocillos o incluso de 384 pocillos, haciendo pasar la luz a través de cada pocillo verticalmente.
¿Dónde se mide la absorbancia?
La absorbancia se mide usando un espectrofotómetro o un lector de microplacas, que es un instrumento que dirige la luz de una longitud de onda específica a través de una muestra y mide la cantidad de luz que absorbe la muestra.
Espectrofotómetro frente al lector de placas
Un espectrofotómetro convencional mide la absorbancia de una muestra cada vez, normalmente colocada en una cubeta a través de la cual se hace pasar la luz horizontalmente. Un lector de placas de absorbancia ofrece un mayor rendimiento y puede medir la absorbancia de las muestras en microplacas, normalmente de 96 pocillos o incluso de 384 pocillos, haciendo pasar la luz a través de cada pocillo verticalmente.
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¿Cómo se realiza un protocolo de ELISA de absorbancia?
Un ELISA, o ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima, es un método utilizado para detectar cuantitativamente un antígeno en una muestra. La mayoría de los ELISA se realiza en microplacas y el fondo de los pocillos de la microplaca sirve como superficie sólida a la cual se fija el antígeno de interés, directamente o mediante un anticuerpo. Para detectar el antígeno se utiliza un conjugado enzimático, que reacciona con el sustrato para producir una solución coloreada. Se utiliza un lavador de microplacas para eliminar el material inespecífico no unido de los pocillos y con un lector de absorbancia de placas de ELISA se detecta el cambio de color que se produce cuando el antígeno diana está presente.
¿Cómo se realiza un protocolo de ELISA de absorbancia?
Un ELISA, o ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima, es un método utilizado para detectar cuantitativamente un antígeno en una muestra. La mayoría de los ELISA se realiza en microplacas y el fondo de los pocillos de la microplaca sirve como superficie sólida a la cual se fija el antígeno de interés, directamente o mediante un anticuerpo. Para detectar el antígeno se utiliza un conjugado enzimático, que reacciona con el sustrato para producir una solución coloreada. Se utiliza un lavador de microplacas para eliminar el material inespecífico no unido de los pocillos y con un lector de absorbancia de placas de ELISA se detecta el cambio de color que se produce cuando el antígeno diana está presente.
¿Cómo afecta la luz dispersa a la lectura de la densidad óptica (DO)?
Luz difusa es un término general utilizado para designar la luz no deseada que llega al detector de un instrumento. El efecto de la luz difusa sobre una lectura de absorbancia es a menudo una DO inesperadamente baja; la absorbancia medida es más baja que la absorbancia real de la muestra. El efecto se observa normalmente sobre la linealidad y es mayor cuando se miden DO por encima de 2,0-2,5. El usuario no puede corregir la luz difusa y por lo general no está causada por un error del usuario, siendo sus posibles causas componentes ópticos como filtros de excitación deteriorados. Los espectrofotómetros y los lectores de placas de absorbancia habitualmente incorporan funciones para minimizar la luz difusa.
¿Cómo afecta la luz dispersa a la lectura de la densidad óptica (DO)?
Luz difusa es un término general utilizado para designar la luz no deseada que llega al detector de un instrumento. El efecto de la luz difusa sobre una lectura de absorbancia es a menudo una DO inesperadamente baja; la absorbancia medida es más baja que la absorbancia real de la muestra. El efecto se observa normalmente sobre la linealidad y es mayor cuando se miden DO por encima de 2,0-2,5. El usuario no puede corregir la luz difusa y por lo general no está causada por un error del usuario, siendo sus posibles causas componentes ópticos como filtros de excitación deteriorados. Los espectrofotómetros y los lectores de placas de absorbancia habitualmente incorporan funciones para minimizar la luz difusa.
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Ensayos de viabilidad celular, proliferación celular, citotoxicidad (MTT, XTT, MTS)
Se pueden utilizar ensayos colorimétricos con sales de tetrazolio como MTT, XTT y MTS para medir la proliferación celular y la citotoxicidad. Por ejemplo, el ensayo de MTT depende de la reducción del MTT por las enzimas presentes en células viables para formar un producto azul, el formazán, que se puede cuantificar midiendo la absorbancia. La elección del ensayo puede basarse en el flujo de trabajo deseado y en el tiempo necesario.
Consulte la nota de aplicación para conocer algunos de estos métodos:
Ensayos de viabilidad celular, proliferación celular, citotoxicidad (MTT, XTT, MTS)
Se pueden utilizar ensayos colorimétricos con sales de tetrazolio como MTT, XTT y MTS para medir la proliferación celular y la citotoxicidad. Por ejemplo, el ensayo de MTT depende de la reducción del MTT por las enzimas presentes en células viables para formar un producto azul, el formazán, que se puede cuantificar midiendo la absorbancia. La elección del ensayo puede basarse en el flujo de trabajo deseado y en el tiempo necesario.
Consulte la nota de aplicación para conocer algunos de estos métodos:
ELISA/inmunoensayos (cuantificación de antígenos, anticuerpos, citoquinas, etc.)
Los ensayos de inmunoadsorción ligados a enzima (ELISA) se utilizan para medir la cantidad de una proteína específica, normalmente en un formato de microplaca, y los resultados se detectan frecuentemente a través de la absorbancia en el rango de longitudes de onda visibles.
Aquí encontrará varias notas de aplicación sobre los ELISA que le pueden resultar interesantes:
- Cuantificación de las concentraciones de interleuquina-8 en el lector de microplacas SpectraMax ABS Plus con el kit de ELISA SimpleStep
- Detección de melamina de alto rendimiento con los ensayos AgraQuant Melamine de Romer Labs y los lectores de absorbancia de Molecular Devices
- Cuantificación del gluten en la cerveza con un método de ELISA aprobado por la ASBC
ELISA/inmunoensayos (cuantificación de antígenos, anticuerpos, citoquinas, etc.)
Los ensayos de inmunoadsorción ligados a enzima (ELISA) se utilizan para medir la cantidad de una proteína específica, normalmente en un formato de microplaca, y los resultados se detectan frecuentemente a través de la absorbancia en el rango de longitudes de onda visibles.
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Cuantificación de ADN/ARN
La absorbancia de una muestra de ADN medida a 260 nm en un espectrofotómetro o lector de microplacas puede utilizarse para calcular su concentración. La cuantificación de la absorbancia del ADN funciona en muestras cuya concentración oscila de aproximadamente 0,25 µg/ml a aproximadamente 125 µg/ml en un formato de microplaca.
Descubra cómo se mide la absorbancia en nuestros lectores de microplacas de absorbancia con nuestras notas de aplicación destacadas:
Cuantificación de ADN/ARN
La absorbancia de una muestra de ADN medida a 260 nm en un espectrofotómetro o lector de microplacas puede utilizarse para calcular su concentración. La cuantificación de la absorbancia del ADN funciona en muestras cuya concentración oscila de aproximadamente 0,25 µg/ml a aproximadamente 125 µg/ml en un formato de microplaca.
Descubra cómo se mide la absorbancia en nuestros lectores de microplacas de absorbancia con nuestras notas de aplicación destacadas:
Historia de los clientes: En el lector de placas de absorbancia se prueban los sintetizadores de ADN/ARN
En OligoMaker ApS utilizan el lector SpectraMax 190 para analizar los sintetizadores de ADN/ARN
“Utilizamos el lector SpectraMax 190 como paso importante en las pruebas de los sintetizadores de ADN/ARN que fabricamos. Tenemos que cuantificar los cebadores y las sondas para determinar qué cantidad de ADN/ARN se sintetiza en el sintetizador de ADN/ARN”.
Historia de los clientes: En el lector de placas de absorbancia se prueban los sintetizadores de ADN/ARN
En OligoMaker ApS utilizan el lector SpectraMax 190 para analizar los sintetizadores de ADN/ARN
“Utilizamos el lector SpectraMax 190 como paso importante en las pruebas de los sintetizadores de ADN/ARN que fabricamos. Tenemos que cuantificar los cebadores y las sondas para determinar qué cantidad de ADN/ARN se sintetiza en el sintetizador de ADN/ARN”.
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Ensayos de endotoxinas
La monitorización de contaminantes es un paso crítico durante el proceso de producción en la industria farmacéutica y de productos sanitarios. Un contaminante frecuente, la endotoxina, puede causar fiebre, inflamación, dolor de cabeza, náuseas e incluso la muerte. Afortunadamente, las endotoxinas se pueden monitorizar fácilmente mediante ensayos turbidimétricos, colorimétricos o fluorométricos.
En estas notas de aplicación se describen los diferentes tipos de ensayos de endotoxinas:
Ensayos de endotoxinas
La monitorización de contaminantes es un paso crítico durante el proceso de producción en la industria farmacéutica y de productos sanitarios. Un contaminante frecuente, la endotoxina, puede causar fiebre, inflamación, dolor de cabeza, náuseas e incluso la muerte. Afortunadamente, las endotoxinas se pueden monitorizar fácilmente mediante ensayos turbidimétricos, colorimétricos o fluorométricos.
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Cinética enzimática, proliferación microbiana/bacteriana
Muchos experimentos biológicos requieren la monitorización de la proliferación bacteriana o la medición de cambios enzimáticos durante largos periodos de tiempo (horas, días o incluso semanas).
Aquí encontrará algunas notas de aplicación destacadas que ilustran cómo configurar ensayos cinéticos para medir la proliferación bacteriana usando nuestros sistemas y software:
Cinética enzimática, proliferación microbiana/bacteriana
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Historia de los clientes: Lectores de placas de absorbancia utilizados en la investigación de biopelículas
En la Université Catholique de Louvain utilizan nuestros lectores multimodo y de absorbancia SpectraMax para ayudar a combatir las biopelículas
“Otra gran ventaja”, comenta Wafi Siala de la UCL, “es la gran opción de tamaños de microplacas desde 6 a 384 pocillos que ofrece el SpectraMax serie M”.
Historia de los clientes: Lectores de placas de absorbancia utilizados en la investigación de biopelículas
En la Université Catholique de Louvain utilizan nuestros lectores multimodo y de absorbancia SpectraMax para ayudar a combatir las biopelículas
“Otra gran ventaja”, comenta Wafi Siala de la UCL, “es la gran opción de tamaños de microplacas desde 6 a 384 pocillos que ofrece el SpectraMax serie M”.
Aplicaciones con microvolúmenes
La cuantificación de muchos tipos de muestra se realiza a través de mediciones de la absorbancia en una cubeta o microplaca. No obstante, cuando el material es escaso o las muestras son muy valiosas, se requiere la cuantificación de volúmenes de muestra muy bajos. Hay disponibles instrumentos y accesorios que permiten la cuantificación en volúmenes de tan solo 2 µl, o incluso 0,5 µl.
Más información sobre nuestros instrumentos y técnicas con microvolúmenes:
Aplicaciones con microvolúmenes
La cuantificación de muchos tipos de muestra se realiza a través de mediciones de la absorbancia en una cubeta o microplaca. No obstante, cuando el material es escaso o las muestras son muy valiosas, se requiere la cuantificación de volúmenes de muestra muy bajos. Hay disponibles instrumentos y accesorios que permiten la cuantificación en volúmenes de tan solo 2 µl, o incluso 0,5 µl.
Más información sobre nuestros instrumentos y técnicas con microvolúmenes:
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Mediciones de densidad óptica usando la tecnología PathCheck
Los espectrofotómetros y los lectores de microplacas de UV/VIS se diferencian fundamentalmente en la geometría del haz. En los espectrofotómetros, las muestras se leen a través de las cubetas o tubos con una trayectoria de la luz de 1 cm horizontal, haciendo más sencillos los ensayos basados en coeficientes de extinción. En los lectores de microplacas, el haz de luz vertical da lugar a una trayectoria que depende del volumen de líquido de cada pocillo. Este problema se ha solventado con la tecnología PathCheck de Molecular Devices que corrige automáticamente las mediciones de densidad óptica (DO) a una trayectoria de 1 cm.
En estas notas de aplicación se discuten los principios y usos de la tecnología PathCheck:
Mediciones de densidad óptica usando la tecnología PathCheck
Los espectrofotómetros y los lectores de microplacas de UV/VIS se diferencian fundamentalmente en la geometría del haz. En los espectrofotómetros, las muestras se leen a través de las cubetas o tubos con una trayectoria de la luz de 1 cm horizontal, haciendo más sencillos los ensayos basados en coeficientes de extinción. En los lectores de microplacas, el haz de luz vertical da lugar a una trayectoria que depende del volumen de líquido de cada pocillo. Este problema se ha solventado con la tecnología PathCheck de Molecular Devices que corrige automáticamente las mediciones de densidad óptica (DO) a una trayectoria de 1 cm.
En estas notas de aplicación se discuten los principios y usos de la tecnología PathCheck:
Cuantificación de proteínas (ensayos de BCA, Bradford y Lowry)
La concentración de proteína se puede medir directamente, mediante la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro UV, o indirectamente, usando métodos colorimétricos como ensayos de BCA o Bradford.
Aquí encontrará algunas notas de aplicación sobre la cuantificación de proteínas que le pueden resultar interesantes:
- Medición de proteínas totales en lisados celulares con el lector de microplacas SpectraMax ABS Plus
- Cuantificación de proteínas con el lector de microplacas EMax Plus
- Cuantificación directa de proteínas con la microplaca SpectraDrop Micro-Volume
- Optimización de la cuantificación de proteínas con BCA en el lector SpectraMax iD5
Cuantificación de proteínas (ensayos de BCA, Bradford y Lowry)
La concentración de proteína se puede medir directamente, mediante la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro UV, o indirectamente, usando métodos colorimétricos como ensayos de BCA o Bradford.
Aquí encontrará algunas notas de aplicación sobre la cuantificación de proteínas que le pueden resultar interesantes:
- Medición de proteínas totales en lisados celulares con el lector de microplacas SpectraMax ABS Plus
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