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TRF, TR-FRET y HTRF

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Descripción general de TRF/TR-FRET (HTRF)

Fluorescencia resuelta en el tiempo (Time-Resolved Fluorescence, TRF)

Las mediciones de la intensidad de fluorescencia (IF) utilizan fluoróforos convencionales, como la fluoresceína, cuya emisión es de corta duración (del orden de nanosegundos). La excitación de la muestra y la medición de la emisión ocurren de forma simultánea. Aunque los lectores de microplacas tienen una gran capacidad para separar la luz de excitación de la medición de la emisión, esa luz de excitación, junto con la luz de corta duración emitida por los materiales del pocillo o la muestra, contribuye a menudo a que el fondo sea elevado.

La fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) reduce el fondo mediante un fluoróforo lantánido, como el europio o el terbio, que emite fluorescencia de larga duración. Esta fluorescencia de larga duración se prolonga varios milisegundos, por lo que la excitación del fluoróforo a través de una fuente de luz pulsada (p. ej., una lámpara de flash), seguida de una demora y, posteriormente, de la medición de la señal (“ventana de recuento”), permite que la fluorescencia de corta duración (con una duración de tan solo nanosegundos) desaparezca antes de realizar la medición. En los ensayos que utilizan fluorescencia resuelta en el tiempo, la relación señal/ruido aumenta considerablemente. Los lantánidos utilizados con más frecuencia son europio, terbio y samario. Estos se utilizan habitualmente en forma de complejos de quelato o criptato que ofrecen una intensidad y una estabilidad de la señal adecuadas.

 

 

Fluorescencia resuelta en el tiempo (Time-Resolved Fluorescence, TRF)

Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer, TR-FRET)

 

Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer, TR-FRET)

sin FRET

El donador y el aceptor son distintos

FRET

El donador y el aceptor están muy próximos

La TR-FRET combina la medición resuelta en el tiempo (TR) de la fluorescencia con la tecnología de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET). En los ensayos con FRET, las biomoléculas (p. ej., proteínas) se marcan con fluoróforos donador y aceptor. Cuando las biomoléculas interactúan, los fluoróforos donador y aceptor se aproximan. De este modo, cuando el donador se excita, puede transferir su energía de emisión al aceptor, que a su vez emite fluorescencia a una longitud de onda específica. Las emisiones de fluorescencia del donador y del aceptor tienen longitudes de onda diferentes que pueden diferenciarse entre sí con un lector de microplacas, lo que permite la cuantificación de la interacción biomolecular.

Al utilizar como donadores fluoróforos lantánidos, que tienen una emisión de fluorescencia de larga duración, los ensayos con TR-FRET emplean la medición resuelta en el tiempo de la fluorescencia para eliminar la fluorescencia de fondo de corta duración. Gracias a la emisión de larga duración del fluoróforo donador, en un ensayo con TR-FRET, la excitación y la emisión de los fluoróforos donador y aceptor pueden medirse también después de reducir la fluorescencia de fondo de corta duración.

Fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF)

Fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF)

HTRF es una tecnología TR-FRET versátil desarrollada por Cisbio para la detección de interacciones biomoleculares. En un ensayo típico de HTRF se utiliza un criptato de europio como donador y el fluoróforo d2 orgánico como aceptor. El donador y el aceptor se pueden usar para marcar diferentes biomoléculas, para aplicaciones que incluyan epigenética, cuantificación de biomarcadores, señalización de GPCR, y mucho más. Los ensayos con HTRF requieren un lector de microplacas con modo de detección TRF que sea compatible con HTRF certificada por Cisbio.

Avances de los clientes

En iTeos utilizan nuestros lectores de microplacas multimodo para identificar tratamientos dirigidos al microambiente inmunitario tumoral.

Más información  

 
 

Ventajas y consideraciones

Una ventaja clave de la detección de TRF y TR-FRET es el reducido fondo y la mayor relación señal-ruido en comparación con la fluorescencia convencional, lo que tiene como resultado una mayor sensibilidad. Además, el ensayo tiene un sólido formato de “mezclar y leer” que no requiere lavados. Esto, junto con la estabilidad del ensayo, facilita la automatización y miniaturización para aplicaciones de cribado.

 

Aplicaciones y ensayos

Los ensayos con TRF y TR-FRET (HTRF) permiten el análisis de interacciones moleculares en procesos bioquímicos y son muy utilizados para estudios con ensayos de quinasas, vías de señalización celular, interacciones proteína-proteína, interacciones ADN-proteína, citotoxicidad celular y unión receptor-ligando.

En la tabla de la derecha se indican ejemplos de ensayos para TR-FRET, junto con varios recursos de fluorescencia resuelta en el tiempo a continuación.
 

Ensayo Donador Aceptor Longitudes de onda
HTRF-Eu/rojo* Criptato de europio XL665 o d2 Ex320 Em1 620/Em2 665
HTRF-Tb/rojo* Criptato de terbio XL665 o d2 Ex340 Em1 620/Em2 665
HTRF-Tb/verde* Criptato de terbio fluoresceína o GFP Ex340 Em1 620/Em2 520
Lanthascreen Tb** Quelato de terbio fluoresceína Ex340 Em1 490/Em2 520
Lanthascreen Eu** Quelato de europio Alexa Fluor 647 Ex320 Em1 620/Em2 665
LANCE (original)*** Quelato de europio Surelight® APC Ex320 Em1 620/Em2 665
LANCE Ultra*** Quelato de europio ULight Ex320 Em1 620/Em2 665

  • Ensayos de citoquinas

    Ensayo HTRF de TNFα humano

    Las citoquinas pro y antiinflamatorias tienen una función importante en las enfermedades autoinmunitarias, inflamatorias e infecciosas. También tienen un papel clave en trastornos metabólicos y en oncología, especialmente en la respuesta inmunitaria antitumoral. Los ensayos HTRF proporcionan una plataforma flexible para la cuantificación de diferentes citoquinas y quimioquinas y son adecuados para monitorizar la liberación de citoquinas y quimioquinas en experimentos con células. Con el lector de microplacas multimodo SpectraMax i3x y el citómetro con adquisición de células SpectraMax® MiniMax™ 300, los usuarios pueden medir la HTRF y la viabilidad celular, así como confirmar la calidad del ensayo mediante la monitorización de la apariencia de las células.

    Consulte nuestros recursos para ensayos de citoquinas:

    eBook: Desde el ELISA hasta la epigenética con HTRF

    Desde el ELISA a la epigenética con HTRF

    Supere los problemas de detección de HTRF con los ajustes optimizados del lector de microplacas y el análisis simplificado.

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  • Ensayos HTRF cAMP, receptores acoplados a Gαi/o

    Ensayos HTRF cAMP dynamic 2 e IP-One

    El AMP cíclico (cAMP, adenosín 3'-5'-monofosfato cíclico) es un segundo mensajero clave en la señalización de GPCR. La generación de cAMP es probablemente la más estudiada de las vías de transducción de señales y está implicada en la respuesta a estímulos sensoriales, hormonas, transmisión nerviosa, y mucho más. Tras la unión del ligando a un GPCR, se produce un cambio conformacional que activa el receptor y a su vez activa la proteína G. La activación de los receptores acoplados a Gαi/o inhibe la generación de cAMP por la adenilil ciclasa.

    Consulte nuestros recursos para Gαi/o

    Ensayos HTRF cAMP, receptores acoplados a Gαs

    Ensayos HTRF cAMP

    El AMP cíclico (cAMP, adenosín 3'-5'-monofosfato cíclico) es un segundo mensajero clave en la señalización de GPCR. La generación de cAMP es probablemente la más estudiada de las vías de transducción de señales y está implicada en la respuesta a estímulos sensoriales, hormonas, transmisión nerviosa, y mucho más. Tras la unión del ligando a un GPCR, se produce un cambio conformacional que activa el receptor y a su vez activa la proteína G. La transducción adicional de la señal depende del tipo de proteína G activada, aunque la activación de Gαs causa la regulación por incremento del cAMP por la enzima adenilato ciclasa.

    Consulte nuestros recursos para Gαs

  • Ensayo HTRF

    Ensayo HTRF

    Los ensayos de HTRF de Cisbio han evolucionado para abarcar las áreas de receptores acoplados a proteína G, quinasas y señalización celular, epigenética y biomarcadores. Hay disponible una gran variedad de reactivos y kits de caja de herramientas para abordar ensayos de receptores nucleares, interacciones proteína-proteína, dimerización de receptores, unión de ligando, internalización de receptores, ensayos enzimáticos, y muchos más.

    HTRF implica el uso de dos fluoróforos, un donador y un aceptor, para marcar proteínas u otras biomoléculas de interés. Cuando las biomoléculas interaccionan, su proximidad permite que se produzca la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) del fluoróforo donador al aceptor. El uso de criptatos de lantánidos fluorescentes de larga duración como donadores permite la detección resuelta en el tiempo de ensayos HTRF, minimizando la fluorescencia de fondo de corta duración procedente de los compuestos y otros materiales. La detección de la FRET resuelta en el tiempo (TR-FRET) con un lector de microplacas proporciona una lectura de la unión biomolecular.

    Lectores de microplacas compatibles con HTRF

    Lectores de microplacas compatibles con HTRF

    Conseguir los mejores resultados de HTRF requiere un lector de microplacas que se haya validado y cumpla las especificaciones de rendimiento de HTRF establecidas por Cisbio. La óptica, la fuente de energía y los detectores de un lector, así como la configuración utilizada para detectar la HTRF, afectan todos ellos al rendimiento. Nuestros lectores utilizan componentes optimizados para la detección de la HTRF, incluido un cartucho de detección de HTRF para los lectores de microplacas multimodo SpectraMax i3x y Paradigm y un módulo de TRF mejorados más filtros validados para el lector SpectraMax iD5.

    El programa de certificación de HTRF de Cisbio garantiza que los lectores que llevan el logotipo “HTRF compatible” cumplen las especificaciones necesarias para un rendimiento de HTRF óptimo. Esta nota técnica presenta los ajustes optimizados validados por Cisbio para los lectores de microplacas compatibles con HTRF de Molecular Devices.

  • Ensayos IP-One, receptores acoplados a Gαq/11

    Ensayos IP-One, receptores acoplados a Gαq/11

    La fosfolipasa C (PLC) es otra diana frecuente de las proteínas G activadas y es crítica para muchos procesos. Por ejemplo, los receptores de trombina en plaquetas utilizan esta vía para favorecer la coagulación de la sangre. Los ensayos competitivos IP-One de Cisbio detectan la acumulación de inositol monofosfato (IP1), un metabolito de IP3 estable posterior inducido por la estimulación de PLC tras la activación del receptor acoplado a Gαq/11. Este kit permite la caracterización directa de agonistas y antagonistas de receptores, tanto en células adherentes como en suspensión.

    Ensayos de quinasas y epigenéticos

    Ensayos de quinasas y epigenéticos

    Las proteína quinasas son enzimas que desempeñan una importante función en varias vías de transducción de señales implicadas en el control del crecimiento celular, metabolismo, diferenciación y apoptosis. Las quinasas son el segundo grupo más importante de dianas de fármacos después de los GPCR. La epigenética es el estudio de los cambios fenotípicos hereditarios que no implican alteraciones en las secuencias nucleotídicas, por ejemplo, cambios como la metilación del ADN y la modificación de las histonas. Estos cambios se han vinculado con el desarrollo de diversas enfermedades, especialmente el cáncer.

    Consulte nuestros recursos para ensayos de quinasas y epigenéticos:

  • Medición del metabolismo oxidativo y la actividad glucolítica

    Medición del metabolismo oxidativo y la actividad glucolítica

    Para sobrevivir, las células necesitan energía en forma de ATP para realizar la mayoría de los procesos biológicos esenciales. Esta energía se genera a través de la glucólisis y la respiración mitocondrial. Aunque ambos procesos producen ATP, la glucólisis puede funcionar en ausencia de oxígeno, mientras que las mitocondrias lo necesitan para la etapa final de la fosforilación oxidativa. Entender cómo estas vías responden a los compuestos efectores puede proporcionar información útil sobre la función general de las células y los mecanismos subyacentes que determinan el destino de la célula.

    Lea nuestra nota de aplicación para saber más sobre la adquisición de datos en tiempo real y el análisis de la progresión del consumo de oxígeno y la actividad glucolítica:

    Configuración optimizada para ensayos Transcreener TR-FRET

    Ensayos Transcreener TR-FRET

    Los ensayos Transcreener® TR-FRET son inmunoensayos competitivos de un solo paso para la detección directa de nucleótidos con una lectura de la transferencia de energía de resonancia de Förster resuelta en el tiempo (TR-FRET) del rojo lejano. Descubra cómo optimizar la configuración para los ensayos Transcreener TR-FRET en los lectores de microplacas multimodo SpectraMax iD5 e i3x.

Recursos más recientes

Recursos de fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF)/TR-FRET (HTRF)