Generación de líneas celulares estables para la producción de vacunas

Paso 1: Transfección estable

El proceso de desarrollo de una línea celular comienza con la introducción de ADN extraño (que codifica la proteína recombinante de interés) en una célula huésped, un proceso conocido como transfección. Una vez realizada la transfección, las células comienzan a expresar la proteína durante un periodo transitorio (normalmente menos de una semana) antes de interrumpir la producción por completo. Sin embargo, una pequeña subpoblación mantiene su capacidad de expresar la proteína recombinante durante largos periodos de tiempo debido a la integración del ADN extraño dentro de su genoma. Estas células se conocen como células transfectadas estables y se seleccionan para pasar a la siguiente fase.

Paso 2: Enriquecimiento del pool

El ADN extraño que codifica la proteína de interés a menudo incluye un marcador seleccionable adicional que se puede utilizar para separar las células transfectadas estables de las células no transfectadas. Por ejemplo, a menudo se añade la proteína verde fluorescente (GFP) al ADN extraño de modo que las células transfectadas muestran fluorescencia y se pueden diferenciar de las células no transfectadas que no tienen fluorescencia. Existe una fuerte correlación entre los niveles de expresión de la proteína recombinante y el marcador GFP incluido en el ADN extraño, lo que permite a los investigadores utilizar la intensidad de fluorescencia de GFP para identificar y enriquecer los pooles de células que muestran una alta expresión de proteína.
 

Paso 3: Aislamiento de células individuales

El proceso de transfección estable, ya sea dirigida o aleatoria, generará una población de células con expresión heterogénea de la proteína. Por tanto, se deben aislar y clonar células individuales para garantizar que la población celular sea genéticamente idéntica, lo que reduce significativamente la heterogeneidad de la expresión. El aislamiento de células individuales es el proceso de separar células vivas individuales a partir de un bloque sólido de tejido o de una suspensión de células para su posterior análisis.
 

Paso 4: Verificación de la monoclonalidad y crecimiento celular

La clonación de célula única es una fase extremadamente crítica del proceso de desarrollo de líneas celulares. Es importante verificar que se aíslan correctamente unas células individuales de otras dentro de una microplaca, lo que a menudo se documenta usado un generador de imágenes. Habitualmente se monitoriza el crecimiento de las células después de la fase de clonación para garantizar que sus propiedades de crecimiento no han cambiado de forma drástica. Esto incluye el proceso de seguimiento del progreso de una única célula a una colonia de células. 
 

Paso 5: Título y cribado de CQA

Esta es una prueba que detecta la cantidad de proteína recombinante o anticuerpos producidos por la línea celular derivada de un único clon.