Monoclonalidad es un término que describe una línea celular que se origina a partir de un único progenitor (una única célula) y es, por tanto, monoclonal. El desarrollo de líneas celulares y la garantía de monoclonalidad son pasos críticos en el proceso de generación de moléculas biofarmacéuticas, como los anticuerpos monoclonales. Tras el aislamiento de una única célula viable con una sólida expresión de la proteína de interés, se puede establecer una línea celular. Un hito clave en este proceso es documentar la prueba de clonalidad para garantizar la reproducibilidad genética de la línea celular.
La documentación de la monoclonalidad es una medida reglamentaria para líneas celulares terapéuticas y normalmente se basa en imágenes, por lo que se registra una imagen de una única célula y se incluye en las presentaciones reglamentarias.
Verificación de la monoclonalidad: visualización del origen de una colonia. El historial (imágenes) del crecimiento de cada pocillo se puede rastrear hasta su punto de partida, lo que proporciona una prueba de la monoclonalidad.
¿Por qué es importante la monoclonalidad?
A medida que las regulaciones para el desarrollo de líneas celulares se vuelven más estrictas, los investigadores deberán realizar la clonación de célula única y proporcionar pruebas de que una línea celular procede de una única célula (prueba de clonalidad). Los métodos tradicionales de clonación (p. ej., dilución límite y FACS) utilizan el análisis estadístico para determinar un nivel de confianza de la monoclonalidad. No obstante, la documentación de la monoclonalidad ha impulsado la necesidad de tecnologías y metodologías más sólidas en el bioprocesamiento. Muchos investigadores utilizan ahora rutinariamente sistemas de adquisición de imágenes, como el generador de imágenes CloneSelect, para verificar la monoclonalidad y monitorizar el crecimiento celular en medios de cultivo celular.
Alta garantía de monoclonalidad para el desarrollo de líneas celulares
El desarrollo de líneas celulares que expresan una proteína de interés específica es crítico para la generación de fármacos biológicos, y los organismos reguladores exigen pruebas de la monoclonalidad para que un fármaco biológico salga al mercado. El método tradicional implica la visualización de los pocillos usando luz blanca transmitida el día 0 para confirmar la presencia de una única célula. Sin embargo, este método no está exento de dificultades, ya que los restos celulares y los artefactos del pocillo pueden confundirse fácilmente con células. En consecuencia, los profesionales que desarrollan líneas celulares normalmente evalúan las células en el estado de colonia y hacen un seguimiento hasta los orígenes de la colonia para confirmar la monoclonalidad.
En el flujo de trabajo se destaca el proceso del sistema generador de imágenes CloneSelect para verificar la monoclonalidad en función del análisis objetivo de imágenes. Acoplado con el sistema CloneSelect Single-Cell Printer para la clasificación de células individuales, mejora el flujo de trabajo con un aumento del crecimiento de los clones y una garantía adicional de la monoclonalidad basada en imágenes.
Clasificación de células individuales en los pocillos de la microplaca – Se deben aislar y clonar células viables únicas para garantizar que la población celular es genéticamente idéntica, lo que reduce significativamente la heterogeneidad de la expresión.
Barrido en la placa de crecimiento global el día 0 y días posteriores – Tomar imágenes de la placa el día 0 y días posteriores. La documentación de la monoclonalidad (una medida reglamentaria para líneas celulares terapéuticas) normalmente se basa en imágenes, por lo que se registra una imagen de una única célula y se incluye en las presentaciones reglamentarias.
Revisión del barrido de la placa y evaluación del crecimiento global – Revisar y analizar las imágenes haciendo un seguimiento de las tasas de crecimiento celular, confluencia, mediciones y formación de colonias.
Confirmación de la monoclonalidad y exportación de los datos de los pocillos para la presentación a las autoridades sanitarias – Confirmar la monoclonalidad y exportar los datos de los pocillos en un informe detallado para su presentación a las autoridades sanitarias.
Mejorar el crecimiento clonal con la clasificación de células individuales
El sistema CloneSelect serie Single-Cell Printer es un sistema completamente automatizado que utiliza tecnología patentada basada en la microfluídica y análisis de imágenes en tiempo real para clasificar y depositar células individuales en microplacas estándar, proporcionando simultáneamente garantía de monoclonalidad mediante documentación con imágenes. Resuelve las deficiencias de la dilución límite y la clasificación de células mediante citometría de flujo ofreciendo pruebas de la clonalidad basadas en imágenes, el depósito rápido y eficaz de células individuales basada en luz blanca (sistemas c.sight y f.sight) o en fluorescencia opcional (solo sistemas f.sight), un excelente crecimiento celular después de depositar la célula, un riesgo mínimo de contaminación cruzada y un coste de mantenimiento extremadamente bajo. En combinación con el generador de imágenes CloneSelect, la serie Single-Cell Printer muestra mejoras en estos dos flujos de trabajo con un aumento del crecimiento clonal y una garantía adicional de la monoclonalidad basada en imágenes.
Tecnología CloneSelect Single Cell Printer (A) Después de cargar una muestra con células en el cartucho, éste se monta en la impresora de células únicas (SCP) y se puede iniciar una serie de impresión. Durante el procedimiento de impresión, un accionado piezoeléctrico genera gotas continuamente en una secuencia predecible. Las gotas que no contienen células o que contienen más de una célula se desvían mediante un mecanismo de vacío directamente debajo de la boquilla. Cuando se identifican células individuales, un mecanismo de obturación inhibe el vacío, lo que permite que la gota que contiene una única célula caiga en el pocillo. (B) Cuando se detecta una única célula, se toman cinco imágenes para proporcionar pruebas de la clonalidad en la boquilla. Las imágenes 1-3 muestran la presencia de una célula antes de la expulsión de la gota, en la imagen 4 se marca la región que contiene la célula única y la imagen 5 muestra la boquilla después de la expulsión de la gota.
Adquisición de imágenes de la microplaca, caracterizaciones de los clones y generación de informes
(A) Se toman imágenes de los clones del día 10 procedentes de la sesión de impresión con SCP. La pestaña “Plate Thumbnails” (Miniaturas de placa) permite la visualización de las colonias. Haciendo clic en pocillos individuales el usuario puede acceder a la pestaña “View Image” (Ver imagen), donde se muestra la imagen del pocillo completo. (B) La pestaña “Loci Count” (Recuento de loci) permite optimizar el recuento de colonias ajustando el área y la compactación, una medida de redondez, de una colonia. (C) En la pestaña “Generate Report” (Generar informe) (recuadros verdes) se pueden designar y ajustar regiones de células para cada punto temporal en una serie para caracterizar el crecimiento de una única célula hasta formar una colonia.
Qué es monoclonal y qué no
Utilizando el software CloneSelect Imager para ampliar colonias individuales inmovilizadas, es posible hacer un seguimiento del crecimiento y determinar si una colonia es monoclonal revisando las imágenes de la colonia en diferentes momentos. En la siguiente figura se muestran las imágenes de dos colonias. Observando el crecimiento de las dos colonias y haciendo un seguimiento de las imágenes hasta el día 0, se puede determinar si la colonia se originó o no a partir de una única célula. La adición de las microesferas (círculos amarillos) a los medios semisólidos sirve de referencia de la ubicación para confirmar que se están tomando imágenes siempre de la misma colonia.
Crecimiento de células CHO-s en medio semisólido CloneMedia CHO Growth A Se utilizó el generador de imágenes CloneSelect para capturar imágenes de las placas de 6 pocillos en varios puntos temporales. El día 0 se observa claramente en la fila superior que hay una única célula, mientras que en la fila inferior se observan dos células. El círculo amarillo muestra la posición de una microesfera que sirve de referencia de la ubicación para confirmar que se están tomando imágenes siempre de la misma colonia.
Provisión de pruebas de monoclonalidad con imágenes (informe)
Proporcionar pruebas de monoclonalidad con imágenes en el proceso de desarrollo de líneas celulares no es tan simple como exportar una imagen de una célula individual. Por ejemplo, también se deben inspeccionar las imágenes de alta resolución del pocillo completo para garantizar la ausencia de una segunda célula.
Con tan solo unos pocos clics, la función Informe de monoclonalidad del generador de imágenes CloneSelect™ (CSI) organiza de forma objetiva las pruebas con imágenes de apoyo necesarias para establecer la clonalidad en un informe que se puede compartir fácilmente, ahorrando a los investigadores las horas que normalmente se necesitan para hacer el mismo proceso manualmente.
Garantía de clonalidad segura usando calceína AM con efecto mínimo sobre la viabilidad
Aquí mostramos un flujo de trabajo optimizado usando el reactivo de fluorescencia calceína AM, junto con un generador de imágenes CloneSelect™ con capacidad de fluorescencia que muestra una viabilidad similar a la obtenida en condiciones sin marcaje, proporcionando simultáneamente una alta garantía de clonalidad.
Garantía de clonalidad segura usando calceína AM con efecto mínimo sobre la viabilidad
Aquí mostramos un flujo de trabajo optimizado usando el reactivo de fluorescencia calceína AM, junto con un generador de imágenes CloneSelect™ con capacidad de fluorescencia que muestra una viabilidad similar a la obtenida en condiciones sin marcaje, proporcionando simultáneamente una alta garantía de clonalidad.
eBook: Optimice sus líneas celulares de alto valor
En este eBook presentamos una descripción general del flujo de trabajo para el desarrollo de líneas celulares, así como soluciones de alto rendimiento para acelerar el proceso y permitir una selección más fácil y rápida de las líneas de células de mamífero de alta producción.
eBook: Optimice sus líneas celulares de alto valor
En este eBook presentamos una descripción general del flujo de trabajo para el desarrollo de líneas celulares, así como soluciones de alto rendimiento para acelerar el proceso y permitir una selección más fácil y rápida de las líneas de células de mamífero de alta producción.
Método fluorescente para la identificación de células CHO-S monoclonales
Métodos rápidos de verificación de la monoclonalidad para impulsar el desarrollo de líneas celulares
Aunque la verificación de la monoclonalidad a través de la adquisición de imágenes de luz blanca es posible, los restos celulares, el polvo y las burbujas de aire lo dificultan y lleva tiempo identificar células únicas, lo que puede hacer que se descarten clones de alto valor. Presentamos un método fluorescente para la identificación de células CHO-S monoclonales utilizando el colorante CMDFA verde CellTracker.
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Aunque la verificación de la monoclonalidad a través de la adquisición de imágenes de luz blanca es posible, los restos celulares, el polvo y las burbujas de aire lo dificultan y lleva tiempo identificar células únicas, lo que puede hacer que se descarten clones de alto valor. Presentamos un método fluorescente para la identificación de células CHO-S monoclonales utilizando el colorante CMDFA verde CellTracker.
Alta garantía de monoclonalidad para el desarrollo de líneas celulares
Habitualmente se realiza la dilución límite o la clasificación de células activada por fluorescencia para sembrar células individuales en un pocillo. Después, mediante microscopía, se determina el número de células sembradas en cada pocillo y se monitoriza el crecimiento. Aunque la verificación de la monoclonalidad a través de la adquisición de imágenes de luz blanca es posible, los restos celulares, el polvo y las burbujas de aire lo dificultan y lleva tiempo identificar células únicas, lo que puede hacer que se descarten clones de alto valor.
Alta garantía de monoclonalidad para el desarrollo de líneas celulares
Habitualmente se realiza la dilución límite o la clasificación de células activada por fluorescencia para sembrar células individuales en un pocillo. Después, mediante microscopía, se determina el número de células sembradas en cada pocillo y se monitoriza el crecimiento. Aunque la verificación de la monoclonalidad a través de la adquisición de imágenes de luz blanca es posible, los restos celulares, el polvo y las burbujas de aire lo dificultan y lleva tiempo identificar células únicas, lo que puede hacer que se descarten clones de alto valor.
Identificación de células CHO-S monoclonales crecidas en medio semisólido
Identificación fiable del crecimiento de células CHO-S monoclonales en medio semisólido
El crecimiento de células CHO en medio CloneMedia CHO Growth A es una forma más eficiente de clonar células CHO que realizar la dilución límite en medio líquido. Los medios semisólidos inmovilizan las células, lo que evita que estas se muevan durante la manipulación habitual. Esto permite a los investigadores hacer un seguimiento fiable del crecimiento de una única célula dentro de la colonia.
Identificación de células CHO-S monoclonales crecidas en medio semisólido
Identificación fiable del crecimiento de células CHO-S monoclonales en medio semisólido
El crecimiento de células CHO en medio CloneMedia CHO Growth A es una forma más eficiente de clonar células CHO que realizar la dilución límite en medio líquido. Los medios semisólidos inmovilizan las células, lo que evita que estas se muevan durante la manipulación habitual. Esto permite a los investigadores hacer un seguimiento fiable del crecimiento de una única célula dentro de la colonia.
Mejora de la eficiencia de clonación con mayor garantía de clonalidad
Un flujo de trabajo que combina el aislamiento de células individuales y la adquisición de imágenes de la microplaca mejora la eficiencia de la clonación con una mayor garantía de clonalidad
Un flujo de trabajo optimizado ahorra tiempo y trabajo y reduce los costes en consumibles y reactivos, incrementando la eficiencia del crecimiento, proporcionando a la vez mayor garantía de clonalidad y una documentación rápida lista para su presentación a las autoridades sanitarias.
Mejora de la eficiencia de clonación con mayor garantía de clonalidad
Un flujo de trabajo que combina el aislamiento de células individuales y la adquisición de imágenes de la microplaca mejora la eficiencia de la clonación con una mayor garantía de clonalidad
Un flujo de trabajo optimizado ahorra tiempo y trabajo y reduce los costes en consumibles y reactivos, incrementando la eficiencia del crecimiento, proporcionando a la vez mayor garantía de clonalidad y una documentación rápida lista para su presentación a las autoridades sanitarias.
Función de Informe de monoclonalidad del generador de imágenes CloneSelect
Con tan solo unos pocos clics, la función Informe de monoclonalidad del generador de imágenes CloneSelect™ organiza de forma objetiva las pruebas con imágenes de apoyo necesarias para establecer la clonalidad en un informe que se puede compartir fácilmente, ahorrando a los investigadores las horas que normalmente se necesitan para hacer el mismo proceso manualmente.
Función de Informe de monoclonalidad del generador de imágenes CloneSelect
Con tan solo unos pocos clics, la función Informe de monoclonalidad del generador de imágenes CloneSelect™ organiza de forma objetiva las pruebas con imágenes de apoyo necesarias para establecer la clonalidad en un informe que se puede compartir fácilmente, ahorrando a los investigadores las horas que normalmente se necesitan para hacer el mismo proceso manualmente.
Simplificación del cribado y selección de líneas de células de mamífero
Uso del sistema ClonePix para evaluar la monoclonalidad
El sistema ClonePix es una potente herramienta para el cribado rápido y aislamiento de líneas de células de mamífero secretoras utilizado habitualmente en la producción de proteínas terapéuticas y anticuerpos monoclonales para investigación. Los datos que se presentan en este tutorial respaldan la idea de que la selección de colonias de células de mamífero en medio semisólido es una forma eficaz de aislar líneas celulares clonales.
Simplificación del cribado y selección de líneas de células de mamífero
Uso del sistema ClonePix para evaluar la monoclonalidad
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