Monoclonalidad
Documentar la monoclonalidad, una medida reglamentaria para las líneas celulares terapéuticas
¿Qué es la monoclonalidad?
Monoclonalidad es un término que describe una línea celular que se origina a partir de un único progenitor (una única célula) y es, por tanto, monoclonal. El desarrollo de líneas celulares y la garantía de monoclonalidad son pasos críticos en el proceso de generación de moléculas biofarmacéuticas, como los anticuerpos monoclonales. Tras el aislamiento de una única célula viable con una sólida expresión de la proteína de interés, se puede establecer una línea celular. Un hito clave en este proceso es documentar la prueba de clonalidad para garantizar la reproducibilidad genética de la línea celular.
La documentación de la monoclonalidad es una medida reglamentaria para líneas celulares terapéuticas y normalmente se basa en imágenes, por lo que se registra una imagen de una única célula y se incluye en las presentaciones reglamentarias.
¿Por qué es importante la monoclonalidad?
A medida que las regulaciones para el desarrollo de líneas celulares se vuelven más estrictas, los investigadores deberán realizar la clonación de célula única y proporcionar pruebas de que una línea celular procede de una única célula (prueba de clonalidad). Los métodos tradicionales de clonación (p. ej., dilución límite y FACS) utilizan el análisis estadístico para determinar un nivel de confianza de la monoclonalidad. No obstante, la documentación de la monoclonalidad ha impulsado la necesidad de tecnologías y metodologías más sólidas en el bioprocesamiento. Muchos investigadores utilizan ahora rutinariamente sistemas de adquisición de imágenes, como el generador de imágenes CloneSelect, para verificar la monoclonalidad y monitorizar el crecimiento celular en medios de cultivo celular.
Alta garantía de monoclonalidad para el desarrollo de líneas celulares
El desarrollo de líneas celulares que expresan una proteína de interés específica es crítico para la generación de fármacos biológicos, y los organismos reguladores exigen pruebas de la monoclonalidad para que un fármaco biológico salga al mercado. El método tradicional implica la visualización de los pocillos usando luz blanca transmitida el día 0 para confirmar la presencia de una única célula. Sin embargo, este método no está exento de dificultades, ya que los restos celulares y los artefactos del pocillo pueden confundirse fácilmente con células. En consecuencia, los profesionales que desarrollan líneas celulares normalmente evalúan las células en el estado de colonia y hacen un seguimiento hasta los orígenes de la colonia para confirmar la monoclonalidad.
En el flujo de trabajo se destaca el proceso del sistema generador de imágenes CloneSelect para verificar la monoclonalidad en función del análisis objetivo de imágenes. Acoplado con el dispensador de células individuales DispenCell para la clasificación de células individuales, mejora el flujo de trabajo con un aumento del crecimiento de los clones y una garantía adicional de la monoclonalidad basada en imágenes.
- Clasificación de células individuales y viabilidad celular: Se deben aislar y clonar células viables únicas para garantizar que la población de células es genéticamente idéntica, lo que reduce significativamente la heterogeneidad de la expresión.
- Barrido de la placa con luz blanca el día 0 y días posteriores: Tomar imágenes de la placa el día 0 y días posteriores. La documentación de la monoclonalidad (una medida reglamentaria para líneas celulares terapéuticas) normalmente se basa en imágenes, por lo que se registra una imagen de una única célula y se incluye en las presentaciones reglamentarias.
- Revisión del barrido de la placa y evaluación del crecimiento global (luz blanca): Revisar y analizar las imágenes haciendo un seguimiento de las tasas de crecimiento celular, confluencia, mediciones y formación de colonias.
- Confirmación de la monoclonalidad y exportación de los datos de los pocillos para la presentación a las autoridades sanitarias: Confirmar la monoclonalidad y exportar los datos de los pocillos en un informe detallado para las presentación a las autoridades sanitarias.
Mejorar el crecimiento clonal con la dispensación de células individuales
La unidad de dispensación de células individuales de DispenCell está equipada con una punta sensora que detecta el paso de las células. A medida que cada célula avanza, se activa una señal eléctrica única. Este trazado eléctrico único se registra inmediatamente, lo que permite al usuario comprobar la prueba de clonalidad inmediatamente después de que se dispensen las células.
La tecnología se basa en la impedancia, por lo que es extremadamente delicada con las células, preservando su viabilidad e integridad para permitir un crecimiento óptimo. El sistema DispenCell utiliza una punta sensora estéril desechable (DispenTip) para detectar y registrar el paso de cada célula que fluye a través de la abertura de DispenTip. Cuando una única célula pasa por la abertura para caer en el pocillo, deja una firma electrónica que aparece como un pico único, mientras que varios picos indicarán dobletes o varias células.
Representación gráfica de la información del pico producido por el dispensador de dos pocillos junto a su imagen generada por CSI-FL. Uno con un único pico y una única célula (superior) y otro con doble pico y dos células (inferior). La célula individual se desarrolla en una colonia y su informe de monoclonalidad se genera usando la función de informe de monoclonalidad de CSI-FL.
Qué es monoclonal y qué no
Utilizando el software CloneSelect Imager para ampliar colonias individuales inmovilizadas, es posible hacer un seguimiento del crecimiento y determinar si una colonia es monoclonal revisando las imágenes de la colonia en diferentes momentos. En la siguiente figura se muestran las imágenes de dos colonias. Observando el crecimiento de las dos colonias y haciendo un seguimiento de las imágenes hasta el día 0, se puede determinar si la colonia se originó o no a partir de una única célula. La adición de las microesferas (círculos amarillos) a los medios semisólidos sirve de referencia de la ubicación para confirmar que se están tomando imágenes siempre de la misma colonia.
Crecimiento de células CHO-s en medio semisólido CloneMedia CHO Growth A Se utilizó el generador de imágenes CloneSelect para capturar imágenes de las placas de 6 pocillos en varios puntos temporales. El día 0 se observa claramente en la fila superior que hay una única célula, mientras que en la fila inferior se observan dos células. El círculo amarillo muestra la posición de una microesfera que sirve de referencia de la ubicación para confirmar que se están tomando imágenes siempre de la misma colonia.
Provisión de pruebas de monoclonalidad con imágenes (informe)
Proporcionar pruebas de monoclonalidad con imágenes en el proceso de desarrollo de líneas celulares no es tan simple como exportar una imagen de una célula individual. Por ejemplo, también se deben inspeccionar las imágenes de alta resolución del pocillo completo para garantizar la ausencia de una segunda célula.
Con tan solo unos pocos clics, la función Informe de monoclonalidad del generador de imágenes CloneSelect™ (CSI) organiza de forma objetiva las pruebas con imágenes de apoyo necesarias para establecer la clonalidad en un informe que se puede compartir fácilmente, ahorrando a los investigadores las horas que normalmente se necesitan para hacer el mismo proceso manualmente.
Métodos para la garantía de monoclonalidad
Más información sobre los diferentes métodos para verificar y documentar la monoclonalidad.