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Edición génica (CRISPR/Cas9)

Soluciones automatizadas para ampliar las posibilidades de la edición génica con la ingeniería CRISPR

¿Qué es la edición génica?

La edición génica es una manipulación genética en la que el ADN genómico de un organismo vivo se deleciona, inserta, sustituye o modifica. La edición génica se dirige a un sitio específico para crear cortes en el ADN por medio de diversas técnicas y no siempre implica mecanismos de reparación. Consta de dos técnicas: inactivación y corrección.

La inactivación consiste en "apagar" un gen diana, y la corrección facilita la reparación del gen defectuoso mediante su escisión. La edición génica tiene un enorme potencial en numerosos campos, como el desarrollo de fármacos, cirugía génica, modelos animales, investigación y tratamiento de enfermedades, alimentación, biocombustibles, síntesis de biomateriales, etc.

Aunque recientemente se está empleando mucho CRISPR, una técnica importante de edición génica, la edición génica se estudió por primera vez a finales de los años 90. Desde la aparición de CRISPR, anteriormente una aplicación ambiciosa, la terapia génica se ha convertido en la aplicación de edición génica más solicitada. Esto se puede lograr a través de dos enfoques: la adición de genes, que se suman al material genético existente para compensar los genes defectuosos o ausente, y la edición de genes, que permite tratar las enfermedades modificando directamente el ADN relacionado con cada enfermedad.

Mecanismo de CRISPR/Cas9

Mecanismo de CRISPR/Cas9. La enzima Cas9 se activa uniéndose primero a un ARN guía y, a continuación, a la secuencia genómica correspondiente que precede inmediatamente a la secuencia PAM de tres nucleótidos. Entonces, la enzima Cas9 genera un corte en la doble cadena y se utiliza la vía NHEJ o la HDR para reparar el ADN, lo que da lugar a una secuencia génica modificada.

Se diseña un ARN guía (ARNg) similar a un ARNcr específico de una región del gen, y la enzima Cas9 puede generar cortes en la doble cadena en la región específica del genoma de la célula huésped (figura 1). Una vez escindida la doble cadena, la célula se someterá a una de las dos siguientes vías de reparación: la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la vía de recombinación dirigida por homología (HDR). La vía NHEJ se utiliza con frecuencia para alterar genes a través de inserciones y deleciones de bases (indels), mientras que la vía HDR se puede utilizar para introducir un gen indicador o una secuencia modificada mediante el intercambio de secuencias entre dos moléculas de ADN similares o idénticas.

Ampliación de la edición génica mediante ingeniería CRISPR

“CRISPR”: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas). Estas secuencias de ADN se descubrieron por primera vez como parte del sistema inmunológico de procariotas, como bacterias y arqueas, y adquirieron importancia como herramienta de edición génica desde 2012 (Jinek et al., 2012). Esta técnica es muy prometedora para multitud de aplicaciones, como por ejemplo, en agricultura, creación de modelos de enfermedades, terapia génica o descubrimiento de fármacos, por nombrar algunos. La precisión lo convierte en una herramienta perfecta para la inserción (knock-ins), deleción (knock-outs) y demás modificaciones de las secuencias de ADN. Ha sustituido en gran medida a las tediosas y caras herramientas de edición génica existentes, como TALENS y ZFNS.

Las secuencias CRISPR contienen ADN de invasores víricos previos llamados espaciadores detrás de cada repetición palindrómica, y estas ayudan a la detección y destrucción de virus similares futuros. Entender este mecanismo (Jinek et al., 2012) permitió el uso por primera vez de CRISPR en células eucariotas (Cong, L, et al., 2013) y posteriormente en otros tipos celulares más microorganismos pertenecientes a diferentes campos. Los sistemas CRISPR-Cas9 tienen dos componentes principales que forman un complejo ribonucleoproteína. El primer componente o ARN guía se une a una secuencia de ADN complementario en el genoma y el segundo componente Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) escinde la doble cadena en el sitio objetivo. Un motivo adyacente del protoespaciador (PAM) es donde se une inicialmente la nucleasa para realizar el corte en sentido 5'. Las diferentes nucleasas CRISPR tienen diferentes sitios PAM y una vez realizado el corte, los sistemas de reparación de las células se activan y también se inicia la edición del genoma.

Flujo de trabajo de edición génica

El flujo de trabajo de edición génica usando mecanismos de CRISPR para obtener una línea celular modificada confirmada consta de varios pasos. La optimización efectiva de estos pasos, usando las herramientas correctas contribuye a un proceso eficaz para acortar tiempo, esfuerzos y costes de diversos avances científicos. Esta estrategia ayuda a acelerar la I+D, revoluciona el descubrimiento de fármacos, la cura de enfermedades, la producción de cultivos modificados genéticamente, etc. Discutimos los pasos involucrados y las soluciones efectivas que ofrecemos para ayudar a las comunidades científicas de todo el mundo a lograr sus objetivos a través de la edición génica.

Soluciones de investigación para validar ediciones génicas CRISPR/Cas9

La familia de instrumentos de Molecular Devices puede utilizarse de forma eficaz para realizar o seleccionar experimentos, lo que garantiza el éxito de los esfuerzos de edición génica. El nuevo generador de imágenes CloneSelect Imager Florescence (CSI-FL) proporciona garantía de monoclonalidad desde el día 0 tras la impresión de células individuales, eficiencia de la transfección, confluencia celular y datos de cribado con fluorescencia multicanal para validar la eficacia de la edición génica con tiempos de seguimiento más cortos, bajo riesgo de exceso de pases y robótica. 

Además, se puede utilizar nuestro lector de microplacas multimodo SpectraMax i3x para evaluar la eficiencia de la transfección, monitorizar el crecimiento celular, cuantificar el ADN y las proteínas y validar las ediciones CRISPR/Cas9 a través del análisis mediante inmunotransferencia ScanLater. Se pueden adquirir imágenes de alta calidad de autofagosomas utilizando el sistema ImageXpress Micro Confocal, mientras que el software MetaXpress HCI puede identificar y cuantificar autofagosomas individuales de cada célula, lo que nos permite analizar los cambios fenotípicos que tienen lugar en la edición génica CRISPR/Cas9.

  • Agilización del desarrollo de líneas celulares modificadas genéticamente

    Agilización del desarrollo de líneas celulares modificadas genéticamente

    Descubra cómo todos los nuevos generadores de imágenes CloneSelect® Imager FL pueden ayudar a detectar fácilmente células transfectadas con éxito, acortando los plazos de desarrollo de líneas celulares y ampliando su investigación más rápidamente. Rechace grupos de baja eficiencia de transfección en una etapa inicial, confirme y realice un seguimiento de varias ediciones CRISPR con la detección de fluorescencia multicanal y realice cribados de células con exactitud y confianza mientras reduce el riesgo de pasar por alto alteraciones con el rediseño de la robótica.

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    Cribado de la productividad y titulación de clones

    Cribado de la productividad y titulación de clones

    Un componente importante en la identificación de clones de alto valor es la determinación de la productividad de colonias derivadas de una única célula. El cribado de la productividad usando los métodos tradicionales es laborioso y requiere mucho tiempo; generalmente es un proceso de varios pasos que implica el aislamiento de células individuales mediante dilución límite seguido de la determinación del título mediante ELISA. El sistema ClonePix 2 combina la selección fenotípica, el aislamiento de células individuales y el cribado de la productividad en un único paso, lo que acorta considerablemente los tiempos de cribado y aumenta el número de candidatos.

  • Garantía fiable de clonalidad usando calceína AM

    Garantía fiable de clonalidad usando calceína AM

    Garantía de clonalidad segura usando calceína AM con efecto mínimo sobre la viabilidad

    Aquí mostramos un flujo de trabajo optimizado usando el reactivo de fluorescencia calceína AM, junto con un generador de imágenes CloneSelect™ con capacidad de fluorescencia que muestra una viabilidad similar a la obtenida en condiciones sin marcaje, proporcionando simultáneamente una alta garantía de clonalidad.

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    Experimentos de edición genómica CRISPR/Cas9

    Experimentos de edición genómica CRISPR/Cas9

    El sistema de edición génica CRISPR/Cas9 es una herramienta muy popular para estudiar la función génica gracias a su relativa facilidad de uso y a su exactitud. Además, el sistema tiene un enorme potencial para el tratamiento de enfermedades hereditarias. La validación de la edición génica CRISPR/Cas9 es necesaria para garantizar que los genes de interés se han silenciado o reducido su expresión con éxito. Aquí demostramos cómo se puede utilizar la familia de instrumento de Molecular Devices en experimentos de edición génica mediante el uso de CRISPR/Cas9 para reducir la expresión de la proteína relacionada con la autofagia 5 (ATG5) en células HEK293.

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  • Monoclonalidad

    Garantía de monoclonalidad

    El desarrollo de líneas celulares y la garantía de monoclonalidad son pasos críticos en el proceso de generación de moléculas biofarmacéuticas, como los anticuerpos monoclonales. Tras el aislamiento de una única célula viable con una sólida expresión de la proteína de interés, se puede establecer una línea celular. Un hito clave en este proceso es documentar la prueba de clonalidad. La documentación de la clonalidad normalmente se basa en imágenes, por lo que se toma una imagen de una única célula y se incluye en las presentaciones reglamentarias.

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    Clasificación de células individuales

    Clasificación de células individuales

    El desarrollo de líneas celulares requiere el descubrimiento de clones derivados de una única célula que produzcan niveles altos y constantes de la proteína terapéutica de interés. El primer paso en el proceso es el aislamiento de células individuales viables. La dilución límite es una técnica que se basa en la probabilidad estadística, pero requiere mucho tiempo. El sistema CloneSelect Single-Cell Printer permite el aislamiento suave de células de forma que maximiza la viabilidad celular y proporciona una prueba directa de la clonalidad a través de una serie de cinco imágenes capturadas cuando se dispensan las células.

  • Eficiencia de la transfección

    Eficiencia de la transfección

    La eficiencia de transfección de un gen indicador fluorescente se puede monitorizar de diferentes formas. Una forma es medir la fluorescencia con un lector de microplacas. Esto permite evaluar el nivel global de fluorescencia en cada pocillo problema, pero no proporciona el porcentaje de células transfectadas. Una forma de evaluar la eficiencia de transfección que proporciona más información es analizar las células usando un citómetro con adquisición de imágenes en el que el número de células que expresan fluorescencia detectable se puede comparar con el número total de células. El citómetro con adquisición de imágenes tiene el beneficio añadido de permitir el cálculo de la confluencia celular antes de la transfección, de modo que esta información pueda utilizarse como parte del desarrollo del ensayo.

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    Valide células editadas con CRISPR utilizando inmunotransferencia

    Valide células editadas con CRISPR utilizando inmunotransferencia

    La tecnología de edición génica CRISPR requiere una cuidadosa monitorización de todo el proceso para garantizar resultados exactos. El lector de microplacas multimodo SpectraMax i3x proporciona una solución completa para analizar los resultados de un experimento de edición génica CRISPR desde la transfección inicial a la confirmación de la reducción de la expresión de la proteína. Con el citómetro MiniMax, los investigadores pueden evaluar la eficiencia de transfección mediante la comparación de los recuentos totales de células no marcadas y los recuentos de células transfectadas que expresan fluorescencia. El sistema de detección mediante inmunotransferencia ScanLater permite la detección sensible y el análisis cuantitativo de las proteínas de interés en células control y modificadas mediante CRISPR.

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Recursos más recientes

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