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Electrofisiología patch-clamp

Origen de la famosa guía de Axon:

Guía de técnicas del laboratorio de electrofisiología y biofísica

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Electrofisiología patch-clamp

La técnica de fijación en parche de membrana (patch-clamp) es una versátil herramienta electrofisiológica para entender el comportamiento de los canales iónicos. Todas las célula expresan canales iónicos, pero las células que con más frecuencia se estudian con técnicas de patch-clamp son las neuronas, fibras musculares, cardiomiocitos y ovocitos que sobreexpresan canales de iones individuales.

Para evaluar la conductancia de canales de iones individuales, con un microelectrodo se forma un sellado de alta resistencia con la membrana celular y se retira un parche de la membrana celular que contiene el canal iónico de interés. Alternativamente, mientras se sella el microelectrodo a la membrana celular, este pequeño parche se puede romper permitiendo el acceso eléctrico del electrodo a la célula entera. A continuación se aplica voltaje, formándose una fijación de voltaje (voltage clamp) y se mide la corriente de la membrana. También se puede usar fijación de corriente (current clamp) para medir los cambios en el voltaje de la membrana denominado potencial de membrana. El cambio de voltaje o corriente dentro de las membranas celulares se puede alterar aplicando compuestos para bloquear o abrir canales. Estas técnicas permiten a los investigadores entender cómo se comportan los canales iónicos, tanto en estado normal como patológico, y cómo los diferentes fármacos, iones y otros analitos pueden modificar estas condiciones.

Flujo de trabajo de patch-clamp usando instrumentos Axon

El catálogo de Axon Instruments® proporciona soluciones completas para patch-clamp que incluyen amplificadores, digitalizadores, software y accesorios. Nuestros instrumentos, los mejores de su clase, facilitan la variedad completa de experimentos con la técnica patch-clamp, desde los registros más pequeños de canales individuales a los registros macroscópicos más grandes. La adición del paquete de software Axon pCLAMP 11 crea un flujo de trabajo optimizado que permite experimentos sofisticados y eficientes y la generación de datos de alta calidad Más información sobre la configuración del laboratorio de electrofisiología >

 

Electrofisiología patch-clamp

 

  1. Preparar las soluciones – Hacer soluciones internas y externas. Ajustar los valores de osmolaridad y pH.

  2. Preparar las células o cortes de cerebro – Preparar células en cultivo, neuronas aisladas, cortes de cerebro o animales completos.

  3. Estirar y pulir la pipeta – Preparar el electrodo de registro. Estirar el tubo capilar de vidrio y pulir la punta de la pipeta.

  4. Configurar el sistema de perfusión – Configurar el sistema de perfusión y el software de adquisición de datos. Asegurarse de que el sistema está blindado.

  5. Pinzar una célula – Utilizar el manipulador para tocar la membrana celular con la pipeta. Asegurarse de que se forma un sello eléctrico de alta resistencia.

  6. Adquisición y amplificación de la señal – La señal se amplificará. Para obtener mejores resultados, asegurarse de usar el tipo correcto de amplificador para la investigación.

  7. Digitalización de la señal – La señal analógica es digitalizada para poder analizarla.

  8. Adquisición y análisis de los datos – Con el paquete de software pCLAMP 11 se pueden programar protocolos más largos y sofisticados para obtener un análisis más rápido de los datos y mediciones precisas.

 

Enlaces rápidos a los fundamentos de la electrofisiología patch-clamp:

Más información sobre las técnicas de patch-clamp, desde registro de canales individuales a registros de células completas y potencial de campo extracelular.

  • Potencial de acción

    qué-es-potencial-de-acción

     Un potencial de acción es una elevación y posterior caída rápidas del voltaje o potencial de membrana a través de una membrana celular con un patrón característico. Las neuronas y las células musculares son ejemplos de células que envían señales a través de potenciales de acción.

    Más información  

    Análisis de vías celulares

     Análisis de vías celulares

    Los canales iónicos están implicados en muchas vías celulares, por lo que entender la función de los canales iónicos en respuesta a cambios en el potencial de membrana o a la presencia o ausencia de otras moléculas es importante para conocer cómo participan exactamente los canales iónicos en los procesos biológicos normales y patológicos, como la diferenciación y migración celular, estados patológicos y comunicaciones neuronales.

  • cSEVC

    ¿Qué es la fijación de voltaje de electrodo único continuo (cSEVC)?

    ¿Qué es la fijación de voltaje de electrodo único continuo (cSEVC)? Es un método de electrofisiología patch-clamp que hace pasar un voltaje de membrana dentro de una célula y mide el cambio de corriente a medida que se incrementa el voltaje.

    Más información  

    Amplificador de fijación de corriente

    Amplificador de fijación de corriente

    La fijación de corriente es un método utilizado para medir el potencial de membrana resultante (voltaje) a partir de una inyección de corriente. Para medir el potencial de membrana, tanto MultiClamp 700B como Axoclamp 900A monitorizan la caída de voltaje iniciada por la inyección de corriente a lo largo de un resistor en serie. La fijación de corriente se utiliza frecuentemente para inyectar ondas de corriente simuladas, pero realistas, dentro de la célula y monitorizar el efecto en la membrana. Esta técnica es ideal para la evaluación de procesos celulares importantes como los potenciales de acción.

  • Adquisición digital

    Adquisición digital de electrofisiología patch-clamp

    La señal de corriente y voltaje adquirida por el amplificador es una señal analógica, pero para realizar el análisis necesario de los datos para las mediciones de patch-clamp de alta resolución, la señal analógica debe convertirse en una señal digital. Colocado entre el amplificador y el ordenador, el digitalizador realiza esta importante tarea. La calidad de la señal es extremadamente importante y se ve afectada por la frecuencia de muestreo. La última generación de digitalizadores Digidata realiza el muestreo a 500 kHz y puede equiparse con HumSilencer, que elimina el ruido de frecuencia de línea de 50/60 Hz.

    Investigación de enfermedades

    Canales iónicos usados en investigación de enfermedades

    Los canales iónicos están implicados en muchas enfermedades, como hipertensión, arritmias cardíacas, gastrointestinales, trastornos inmunitarios y neurovasculares, dolor patológico y cáncer. Entendiendo la función exacta que desempeñan los canales iónicos en una enfermedad en particular, los investigadores podrían ser capaces de encontrar una forma de actuar sobre estos canales iónicos de tal modo que se altere el curso de la enfermedad.

  • dSEVC

    ¿Qué es la fijación de voltaje de electrodo único discontinuo (dSEVC)?

     En la fijación de voltaje de electrodo único discontinuo (dSEVC), las tareas de registrar el voltaje y pasar la corriente se realizan con la misma micropipeta.

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    Electrofisiología

    Electrofisiología: Patch-clamp

    La electrofisiología es el campo de investigación que estudia los cambios de corriente y voltaje a través de la membrana celular. Las técnicas de electrofisiología se utilizan ampliamente en una gran variedad de aplicaciones de neurociencia y fisiología; desde el entendimiento del comportamiento de canales iónicos individuales en la membrana de una célula, hasta los cambios en la célula completa en el potencial de membrana de una célula y los cambios a mayor escala en el potencial de campo en los cortes de cerebro in vitro o en regiones del cerebro in vivo.

    Más información  

  • Canales iónicos

    Canales iónicos

    Un canal iónico es un grupo de proteínas que forman un poro que atraviesa la bicapa lipídica de una célula. Cada canal es permeable a un ion específico (ejemplos: potasio, sodio, calcio, cloruro). La técnica patch-clamp se utiliza para evaluar la corriente o el voltaje en la membrana asociado a la actividad de canales iónicos a través de la medición directa en tiempo real usando amplificadores ultrasensibles, sistemas de adquisición de datos de alta calidad y un software potente para evaluar los resultados.

    Patch-clamp

    Técnicas de electrofisiología patch-clamp

    En la técnica de fijación en parche de membrana (patch-clamp) se utiliza una micropipeta de vidrio que forma un sello de gigaohmio (GΩ) o gigasello hermético con la membrana celular. La micropipeta contiene un alambre bañado en una solución electrolítica que conduce los iones. La técnica de célula completa implica la rotura de un parche de membrana con una leve succión para proporcionar acceso eléctrico de baja resistencia, lo que permite el control del voltaje transmembrana. Alternativamente, los investigadores pueden desprender un parche de membrana de la célula y evaluar las corrientes a través de canales individuales mediante la técnica patch-clamp “inside-out” (interior hacia afuera) o “outside-out” (exterior hacia afuera).

  • Compensación de resistencia en serie

    Compensación de la resistencia en serie usando el método de registro de célula completa

    La resistencia en serie es la suma de todas las resistencias entre el amplificador y el interior de la célula usando el método de registro de célula completa. Según la ley de Ohms, cuanto mayor es esta resistencia, mayor es la diferencia entre el nivel comando y los valores medidos. Esto genera un error en la medición del voltaje o corriente real, lo que causa potencialmente observaciones inexactas. Para solucionar esto, los amplificadores de Molecular Devices tienen circuitos integrados para mejorar el ancho de banda del registro compensando el error introducido por la caída de voltaje o corriente a través de la resistencia en serie.

    Registro de canal único

    Técnica patch-clamp de registro de canal único

    En la técnica de fijación en parche de membrana (patch-clamp) se utiliza una micropipeta de vidrio que forma un gigasello hermético con la membrana celular. La micropipeta contiene un alambre bañado en una solución electrolítica que conduce los iones. Para medir canales iónicos individuales, se desprende un “parche” de membrana de la célula después de formar un gigasello. Si dentro del parche hay un canal iónico único, se pueden medir las corrientes. Axopatch 200B, con un perfil de ruido extremadamente bajo, es ideal para esta aplicación, maximizando la señal de los canales iónicos con la conductancia más baja.

  • Guía Axon

    Guía Axon

    Guía de técnicas del laboratorio de electrofisiología y biofísica. El objetivo de esta guía es servir como recurso de información y datos para los electrofisiólogos. Cubre una amplia variedad de temas que abarcan desde la base biológica de la bioelectricidad y una descripción de la configuración experimental básica hasta una discusión sobre los mecanismos de análisis de datos y ruido.

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    Amplificador de fijación de voltaje

    Amplificador de fijación de voltaje

    En un experimento con el método de fijación de voltaje, los investigadores pueden controlar el voltaje de la membrana en una célula y medir la corriente transmembrana necesaria para mantener ese voltaje. Este control del voltaje se denomina voltaje de comando. Para mantener este nivel de voltaje de comando, debe inyectarse corriente con un amplificador. La corriente inyectada será igual y opuesta a la corriente que escapa a través de los canales iónicos abiertos, lo que permite al amplificador medir la cantidad de corriente que pasa a través de los canales iónicos abiertos unidos a la membrana.

  • Registro de célula completa

    Técnica patch-clamp de registro de célula completa

    En la técnica patch-clamp de célula completa se utiliza una micropipeta de vidrio que forma un sello de gigaohmio (GΩ) o gigasello hermético con la membrana celular. Esta micropipeta contiene un alambre bañado en una solución electrolítica que conduce los iones. Posteriormente, se rompe un parche de membrana mediante una leve succión de modo que la micropipeta de vidrio proporciona un acceso de baja resistencia a la célula completa, permitiendo así al investigador controlar el voltaje transmembrana y evaluar la suma de todas las corrientes a través de los canales iónicos unidos a la membrana.

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