Electrofisiología
Origen de la famosa guía de Axon:
Guía de técnicas del laboratorio de electrofisiología y biofísica
¿Qué es la electrofisiología?
La electrofisiología es el campo de investigación que estudia los cambios de corriente y voltaje a través de la membrana celular.
Las técnicas de electrofisiología se utilizan ampliamente en una gran variedad de aplicaciones de neurociencia y fisiología; desde el entendimiento del comportamiento de canales iónicos individuales en la membrana de una célula, hasta los cambios en la célula completa en el potencial de membrana de una célula y los cambios a mayor escala en el potencial de campo en los cortes de cerebro in vitro o en regiones del cerebro in vivo.
La técnica de fijación en parche de membrana (patch-clamp), una de las técnicas de electrofisiología más utilizada, es la mejor herramienta para estudiar la actividad de canales iónicos, que son las principales dianas para los investigadores debido a su importante implicación en muchas enfermedades neurológicas y cardiovasculares, así como por sus funciones fisiológicas.
La técnica de registro del potencial de campo extracelular se puede utilizar para estudiar la actividad sináptica de una población de neuronas y puede ayudarnos a entender cómo se procesa la información en el cerebro.
Laboratorio de electrofisiología
La configuración de cada laboratorio de electrofisiología es diferente, lo que refleja los requisitos del experimento o las debilidades del investigador. Aquí se describen los componentes y las consideraciones comunes a todas las configuraciones dedicadas a medir la actividad eléctrica de las células. Una configuración electrofisiológica tiene cuatro requisitos de laboratorio principales:
- Entorno: el medio para mantener un buen estado de la preparación.
- Óptica: un medio de visualizar la preparación.
- Mecánica: un medio de colocar de forma estable el microelectrodo.
- Electrónica: un medio de amplificar y registrar la señal.
En la siguiente ilustración se muestra una configuración estándar de un equipo de electrofisiología, una mesa y jaula para blindar su configuración de interferencias externas; un microscopio con micromanipulador para colocar de forma estable el microelectrodo; un amplificador para recoger y amplificar las señales adquiridas; un digitalizador para convertir las señales analógicas en señales digitales y un software de adquisición y análisis de datos, para configurar los protocolos experimentales y extraer resultados procesables significativos a partir de los datos recopilados.
Solución de electrofisiología: Equipo Axon
El catálogo de instrumentos Axon™ proporciona soluciones completas para patch-clamp que incluyen amplificadores, digitalizadores, software y accesorios. Nuestros instrumentos, los mejores de su clase, facilitan la variedad completa de técnicas de electrofisiología patch-clamp, desde los registros más pequeños de canales individuales a los registros macroscópicos más grandes.
El paquete de software Axon pCLAMP™ 11 es el programa de adquisición y análisis de datos de electrofisiología más utilizado para el control y registro de experimento de fijación de voltaje, fijación de corriente y patch-clamp. Varios aspectos clave enumerados a continuación ayudan a simplificar el flujo de trabajo, permitiéndole hacer experimentos más sofisticados, ejecutarlos con más eficiencia y generar datos de mayor calidad.
AMPLIFICADORES
¿Qué es un amplificador de patch-clamp? Un instrumento que contiene los circuitos necesarios para medir las corrientes eléctricas que pasan a través de los canales iónicos o los cambios en el potencial de membrana de las células.
¿Para qué se utiliza? Para medir cambios en la corriente o el voltaje. El amplificador contiene los circuitos necesarios para medir la corriente que pasa a través de la membrana celular tanto en magnitud como en dirección.
El amplificador también puede medir el potencial de membrana de la célula en respuesta al movimiento de la corriente. Para iniciar el movimiento de la corriente, el investigador puede suministrar un voltaje de comando a la célula y la célula responderá haciendo pasar la corriente necesaria para mantener ese voltaje de comando. Por el contrario, el investigador también puede inyectar corriente y medir, a continuación, el cambio en el potencial de membrana consecuencia del cambio de corriente. Elegir dónde amplificar y filtrar la señal de interés tiene implicaciones en la fidelidad de la señal. El lugar ideal para amplificar la señal está dentro del instrumento de registro. Todos los modelos de amplificadores Axon™ utilizan esta estrategia con control de ganancia variable en la salida para proporcionar amplificación de bajo ruido del potencial de membrana y la corriente de la pipeta. Colocar la amplificación dentro del instrumento de registro minimiza la cantidad de circuitos entre la señal de bajo nivel y los circuitos de amplificación reduciendo las fuentes de ruido extrañas.
Amplificadores disponibles: Axopatch™ 200B, MultiClamp™ 700B, Axoclamp™ 900A
DIGITALIZADORES
¿Qué es? El digitalizador es un instrumento de adquisición de datos que convierte las señales analógicas en señales digitales.
¿Para qué se utiliza? Los digitalizadores capturan datos para su análisis.
La corriente adquirida por el amplificador es una señal analógica, pero con el fin de realizar el análisis necesario de los datos para las mediciones de patch-clamp de alta resolución, la señal analógica debe convertirse en una señal digital. Colocado entre el amplificador y el ordenador, el digitalizador realiza esta importante tarea. La calidad de la señal que recibe el ordenador es extraordinariamente importante, y esto se determina mediante la frecuencia o tasa de muestreo. La última generación de digitalizadores Digidata® tiene la capacidad de realizar el muestreo a 500 kHz y están equipados con la función HumSilencer™, que puede eliminar el ruido de frecuencia de línea de 50/60 Hz.
Amplificadores disponibles: Sistema de adquisición de datos con bajo ruido Digidata 1550B más HumSilencer
SOFTWARE
¿Qué es? El software de adquisición y análisis de datos de patch-clamp es su interfaz con el amplificador, el digitalizador y cualquier otra electrónica de patch-clamp.
¿Para qué se utiliza? Para realizar la adquisición de datos y el análisis de datos, así como para controlar el digitalizador y el amplificador.
Mientras que el amplificador y el digitalizador juntos mantienen el circuito clave que implementa un experimento de patch-clamp, el software controla estos instrumentos para que proporcionen los potenciales deseados y midan la corriente o el voltaje resultantes. Además, el software analiza la señal adquirida con los ajustes definidos por los usuarios, que puede incluir filtrado, normalización, eliminación de ruido, ajuste de la curva y determinación de parámetros.
Amplificadores disponibles: Software pCLAMP™ 11
CABEZAL (HEADSTAGE)
¿Qué es? Un dispositivo que sostiene las micropipetas con circuito integrado para transmitir señales eléctricas desde las micropipetas al amplificador.
¿Para qué se utiliza? La señal eléctrica adquirida por la micropipeta tiene que transmitirse a los sistemas amplificadores para procesar la señal.
Cada cabezal está sincronizado específicamente con el amplificador. Todos los cabezales contienen circuitos eléctricos críticos que reducen el ruido. El cabezal es controlado también mecánicamente por el micromanipulador.
Cabezales disponibles: Cabezales Axon
MICROSCOPIO CON MICROMANIPULADORES
¿Qué es? El microscopio es una herramienta de aumento óptico. El micromanipulador es un dispositivo que manipula mecánicamente la micropipeta con precisión nanométrica, lo que permite normalmente movimientos tridimensionales.
¿Para qué se utiliza? Para colocar de forma precisa y estable la micropipeta en el área de la membrana celular, lo cual es crítico para realizar el registro con éxito.
La colocación con exactitud de un electrodo de parche en una célula de 10-20 µm requiere un sistema óptico que pueda aumentar hasta 300 o 400 veces con realce del contraste (p. ej., Nomarski/DIC, Phase o Hoffman) y un micromanipulador que coloque de forma estable el electrodo en el espacio 3D. Es preferible un microscopio invertido porque permite un acceso más fácil de los electrodos desde arriba de la preparación y también proporciona una plataforma más grande y sólida para atornillar el micromanipulador. Un micromanipulador tiene la capacidad de mover el electrodo distancias muy pequeñas a lo largo de los ejes X, Y y Z. El micromanipulador puede después mantener esa posición indefinidamente.
JAULA DE FARADAY Y AIRE/ANTIVIBRACIÓN
¿Qué es? Una mesa y una jaula alrededor de la configuración de patch-clamp para aislar las fuentes de interferencia.
¿Para qué se utiliza? Para blindar su configuración de las interferencias externas.
Las corrientes eléctricas medidas durante los experimentos de patch-clamp pueden ser extremadamente pequeñas (del orden de picoamperios), por lo que cualquier fuente pequeña de interferencia, como las ondas de radio, pueden distorsionar u oscurecer estas señales. Una jaula de Faraday es una caja de malla metálica alrededor del microscopio y de la cámara de registro; esta es útil para prevenir que los electrodos capten fuentes de ruido extrañas. Asimismo, las fuentes pequeñas de vibración de un orden de magnitud de picometros pueden alterar el registro. Por tanto, todos los componentes deben estar perfectamente colocados a lo largo del tiempo de su experimento, y las mesas de aire o antivibración se utilizan para aislar su configuración de fuentes externas de vibración que pueden interrumpir esta alineación.
