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Electrofisiología

Origen de la famosa guía de Axon:

Guía de técnicas del laboratorio de electrofisiología y biofísica

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¿Qué es la electrofisiología?

La electrofisiología es el campo de investigación que estudia los cambios de corriente y voltaje a través de la membrana celular.

Las técnicas de electrofisiología se utilizan ampliamente en una gran variedad de aplicaciones de neurociencia y fisiología; desde el entendimiento del comportamiento de canales iónicos individuales en la membrana de una célula, hasta los cambios en la célula completa en el potencial de membrana de una célula y los cambios a mayor escala en el potencial de campo en los cortes de cerebro in vitro o en regiones del cerebro in vivo.

La técnica de fijación en parche de membrana (patch-clamp), una de las técnicas de electrofisiología más utilizada, es la mejor herramienta para estudiar la actividad de canales iónicos, que son las principales dianas para los investigadores debido a su importante implicación en muchas enfermedades neurológicas y cardiovasculares, así como por sus funciones fisiológicas.

La técnica de registro del potencial de campo extracelular se puede utilizar para estudiar la actividad sináptica de una población de neuronas y puede ayudarnos a entender cómo se procesa la información en el cerebro.

 

Laboratorio de electrofisiología

La configuración de cada laboratorio de electrofisiología es diferente, lo que refleja los requisitos del experimento o las debilidades del investigador. Aquí se describen los componentes y las consideraciones comunes a todas las configuraciones dedicadas a medir la actividad eléctrica de las células. Una configuración electrofisiológica tiene cuatro requisitos de laboratorio principales:

  1. Entorno: el medio para mantener un buen estado de la preparación.

  2. Óptica: un medio de visualizar la preparación.

  3. Mecánica: un medio de colocar de forma estable el microelectrodo.

  4. Electrónica: un medio de amplificar y registrar la señal.

 

En la siguiente ilustración se muestra una configuración estándar de un equipo de electrofisiología, una mesa y jaula para blindar su configuración de interferencias externas; un microscopio con micromanipulador para colocar de forma estable el microelectrodo; un amplificador para recoger y amplificar las señales adquiridas; un digitalizador para convertir las señales analógicas en señales digitales y un software de adquisición y análisis de datos, para configurar los protocolos experimentales y extraer resultados procesables significativos a partir de los datos recopilados.

 

Equipo de patch-clamp

Solución de electrofisiología: Equipo Axon

El catálogo de instrumentos Axon™ proporciona soluciones completas para patch-clamp que incluyen amplificadores, digitalizadores, software y accesorios. Nuestros instrumentos, los mejores de su clase, facilitan la variedad completa de técnicas de electrofisiología patch-clamp, desde los registros más pequeños de canales individuales a los registros macroscópicos más grandes.

El paquete de software Axon pCLAMP™ 11 es el programa de adquisición y análisis de datos de electrofisiología más utilizado para el control y registro de experimento de fijación de voltaje, fijación de corriente y patch-clamp. Varios aspectos clave enumerados a continuación ayudan a simplificar el flujo de trabajo, permitiéndole hacer experimentos más sofisticados, ejecutarlos con más eficiencia y generar datos de mayor calidad.

 

¿Qué es un amplificador de patch-clamp? Un instrumento que contiene los circuitos necesarios para medir las corrientes eléctricas que pasan a través de los canales iónicos o los cambios en el potencial de membrana de las células.

¿Para qué se utiliza? Para medir cambios en la corriente o el voltaje. El amplificador contiene los circuitos necesarios para medir la corriente que pasa a través de la membrana celular tanto en magnitud como en dirección.

El amplificador también puede medir el potencial de membrana de la célula en respuesta al movimiento de la corriente. Para iniciar el movimiento de la corriente, el investigador puede suministrar un voltaje de comando a la célula y la célula responderá haciendo pasar la corriente necesaria para mantener ese voltaje de comando. Por el contrario, el investigador también puede inyectar corriente y medir, a continuación, el cambio en el potencial de membrana consecuencia del cambio de corriente. Elegir dónde amplificar y filtrar la señal de interés tiene implicaciones en la fidelidad de la señal. El lugar ideal para amplificar la señal está dentro del instrumento de registro. Todos los modelos de amplificadores Axon™ utilizan esta estrategia con control de ganancia variable en la salida para proporcionar amplificación de bajo ruido del potencial de membrana y la corriente de la pipeta. Colocar la amplificación dentro del instrumento de registro minimiza la cantidad de circuitos entre la señal de bajo nivel y los circuitos de amplificación reduciendo las fuentes de ruido extrañas.

Amplificadores disponibles: Axopatch™ 200B, MultiClamp™ 700B, Axoclamp™ 900A

¿Qué es? El digitalizador es un instrumento de adquisición de datos que convierte las señales analógicas en señales digitales.

¿Para qué se utiliza? Los digitalizadores capturan datos para su análisis.

La corriente adquirida por el amplificador es una señal analógica, pero con el fin de realizar el análisis necesario de los datos para las mediciones de patch-clamp de alta resolución, la señal analógica debe convertirse en una señal digital. Colocado entre el amplificador y el ordenador, el digitalizador realiza esta importante tarea. La calidad de la señal que recibe el ordenador es extraordinariamente importante, y esto se determina mediante la frecuencia o tasa de muestreo. La última generación de digitalizadores Digidata® tiene la capacidad de realizar el muestreo a 500 kHz y están equipados con la función HumSilencer™, que puede eliminar el ruido de frecuencia de línea de 50/60 Hz.

Amplificadores disponibles: Sistema de adquisición de datos con bajo ruido Digidata 1550B más HumSilencer

¿Qué es? El software de adquisición y análisis de datos de patch-clamp es su interfaz con el amplificador, el digitalizador y cualquier otra electrónica de patch-clamp.

¿Para qué se utiliza?Para realizar la adquisición de datos y el análisis de datos, así como para controlar el digitalizador y el amplificador.

Mientras que el amplificador y el digitalizador juntos mantienen el circuito clave que implementa un experimento de patch-clamp, el software controla estos instrumentos para que proporcionen los potenciales deseados y midan la corriente o el voltaje resultantes. Además, el software analiza la señal adquirida con los ajustes definidos por los usuarios, que puede incluir filtrado, normalización, eliminación de ruido, ajuste de la curva y determinación de parámetros.

Amplificadores disponibles: Software pCLAMP™11

¿Qué es? Un dispositivo que sostiene las micropipetas con circuito integrado para transmitir señales eléctricas desde las micropipetas al amplificador.

¿Para qué se utiliza? La señal eléctrica adquirida por la micropipeta tiene que transmitirse a los sistemas amplificadores para procesar la señal.

Cada cabezal está sincronizado específicamente con el amplificador. Todos los cabezales contienen circuitos eléctricos críticos que reducen el ruido. El cabezal es controlado también mecánicamente por el micromanipulador.

Cabezales disponibles: Cabezales Axon

¿Qué es? El microscopio es una herramienta de aumento óptico. El micromanipulador es un dispositivo que manipula mecánicamente la micropipeta con precisión nanométrica, lo que permite normalmente movimientos tridimensionales.

¿Para qué se utiliza? Para colocar de forma precisa y estable la micropipeta en el área de la membrana celular, lo cual es crítico para realizar el registro con éxito.

La colocación con exactitud de un electrodo de parche en una célula de 10-20 µm requiere un sistema óptico que pueda aumentar hasta 300 o 400 veces con realce del contraste (p. ej., Nomarski/DIC, Phase o Hoffman) y un micromanipulador que coloque de forma estable el electrodo en el espacio 3D. Es preferible un microscopio invertido porque permite un acceso más fácil de los electrodos desde arriba de la preparación y también proporciona una plataforma más grande y sólida para atornillar el micromanipulador. Un micromanipulador tiene la capacidad de mover el electrodo distancias muy pequeñas a lo largo de los ejes X, Y y Z. El micromanipulador puede después mantener esa posición indefinidamente.

¿Qué es? Una mesa y una jaula alrededor de la configuración de patch-clamp para aislar las fuentes de interferencia.

¿Para qué se utiliza? Para blindar su configuración de las interferencias externas.

Las corrientes eléctricas medidas durante los experimentos de patch-clamp pueden ser extremadamente pequeñas (del orden de picoamperios), por lo que cualquier fuente pequeña de interferencia, como las ondas de radio, pueden distorsionar u oscurecer estas señales. Una jaula de Faraday es una caja de malla metálica alrededor del microscopio y de la cámara de registro; esta es útil para prevenir que los electrodos capten fuentes de ruido extrañas. Asimismo, las fuentes pequeñas de vibración de un orden de magnitud de picometros pueden alterar el registro. Por tanto, todos los componentes deben estar perfectamente colocados a lo largo del tiempo de su experimento, y las mesas de aire o antivibración se utilizan para aislar su configuración de fuentes externas de vibración que pueden interrumpir esta alineación.

Seminario web bajo demanda

Ahorre tiempo en el análisis de datos con la nueva función “Batch Analysis” (Análisis por lotes) del software Axon pCLAMP 11

Ponente: Jeffrey Tang, Ph.D.

Científico sénior global de aplicaciones electrofisiología de Axon

Jeffrey Tang

Regístrese en nuestro seminario web bajo demanda y aprenda a utilizar el módulo de software Clampfit para manipular y analizar los datos electrofisiológicos adquiridos mediante el software pCLAMP™11. Las macros avanzadas de análisis por lotes del software eliminan la necesidad de definir parámetros para cada conjunto, simplificando el análisis de datos. El Dr. Jeffrey Tang proporcionará una visión general de las nuevas funciones Batch Analysis (Análisis por lotes), mostrará el uso de macros, analizará datos por lotes y generará representaciones gráficas.

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  • Guía Axon

    Guía Axon

    Guía de técnicas del laboratorio de electrofisiología y biofísica. El objetivo de esta guía es servir como recurso de información y datos para los electrofisiólogos. Cubre una amplia variedad de temas que abarcan desde la base biológica de la bioelectricidad y una descripción de la configuración experimental básica hasta una discusión sobre los mecanismos de análisis de datos y ruido.

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    Detección automática de eventos

    Detección automática de evento Clampfit

    El módulo de análisis avanzado Clampfit, parte del paquete de software pCLAMP 11, tiene un motor de detección de eventos flexible que analiza potenciales de acción espontáneos y evocados y datos postsinápticos. Los eventos se detectan mediante el cruce del umbral o una búsqueda de plantillas de coincidencia de patrones. Las búsquedas de plantillas analizan eventos espontáneos como PEPS y PIPS sinápticos. Adicionalmente, se pueden detectar simultáneamente varias categorías de eventos. El entorno integrado del software Clampfit 11 vincula los eventos detectados en los datos a las ventanas de hoja de cálculo y gráfico, lo que permite la evaluación contextual rápida del conjunto de datos completo.

  • Análisis de datos por lotes

    Macros de análisis de datos por lotes

    El módulo de análisis avanzado Clampfit, parte del paquete de software pCLAMP 11, contiene una herramienta de análisis de datos por lotes que utiliza macros para acelerar el análisis de datos. El análisis por lotes ahorra tiempo mediante el análisis de cantidades grandes de datos generados por el mismo protocolo. Para usar el análisis por lotes, simplemente active la función de captura de macro, analice los datos y guarde la macro. Cuando sea necesario analizar datos adicionales, simplemente aplique la macro guardada y los datos se analizarán automáticamente.

    Consejos técnicos con Jeffrey Tang: Función del software Axon pCLAMP™ 11 para el análisis por lotes

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    Historia de los clientes: Universidad de Texas

    En la Universidad de Texas utilizan Axon Patch-Clamp

    En la Universidad de Texas utilizan los sistemas Axon Patch-Clamp para evaluar los mecanismos de señalización en el cerebro subyacentes a la memoria y el recuerdo

    “El atractivo de usar protocolos en Clampex (un módulo de software pCLAMP) es que puedes programar el sistema para controlar tanto la estimulación como el registro, lo que hace que el sistema completo sea potente y único. Lo más importante es la versatilidad con la que se pueden introducir muchas estrategias de estimulación diferentes, todo bajo el control de Clampex”.

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  • Herramienta de búsqueda de espigas poblacionales

    Los registros de espigas poblacionales y los experimentos de pulsos pareados, aunque fáciles de recoger, han sido tradicionalmente difíciles de analizar. Esto ya no es así con el módulo de análisis avanzado Clampfit del software pCLAMP 11. La herramienta Population Spike Search (Búsqueda de espigas poblacionales) automáticamente localiza espigas poblacionales en función de los parámetros definidos por el usuario y calcula la amplitud, el área bajo la curva, la semiamplitud, el tiempo de caída y subida, la pendiente de caída y subida, el perfil de espigas poblacionales y los pulsos pareados.

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    Tecnología HumSilencer

    Tecnología HumSilencer

    El ruido de frecuencia de línea de 50/60 Hz, también conocido como zumbido eléctrico, es la fuente más común de ruido de fondo en los experimentos de electrofisiología patch-clamp. Este ruido puede saturar las señales biológicas de interés, haciendo las mediciones de patch-clamp sensibles prácticamente imposibles. La resolución tradicional del problema suele ser solo parcialmente efectiva y puede afectar a la exactitud de los datos. HumSilencer es una tecnología adaptativa, sin filtro, que aprende y elimina el ruido de frecuencia de línea sin utilizar métodos que alteren la exactitud de la señal, como ocurre con los filtros que pueden distorsionar las señales biológicas.

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  • Análisis del potencial de acción

    Investigación del potencial de acción mediante patch-clamp para procesos celulares

    Los potenciales de acción representan procesos celulares importantes. Sin potenciales de acción, el corazón no podría latir y las neuronas no podrían activarse, por lo que la medición de estos eventos es esencial. La herramienta Action Potential Search (Búsqueda de potenciales de acción) en el módulo avanzado Clampfit 11 detecta todos los potenciales de acción en el archivo de datos. Aplica la métrica definida por el usuario y determinada por programa, como amplitud, duración del potencial de acción, tiempo de caída y subida, pendiente de caída y subida, frecuencia y tiempo de pico a pico, amplitud delta por pico, amplitud y duración de postpotencial y potencial umbral.

    Consejos técnicos con Jin Yan: Función del software Axon pCLAMP™ 11 para el análisis del potenciales de acción

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    Sincronización de estudios de electrofisiología y adquisición de imágenes

    Sincronización de estudios de electrofisiología y adquisición de imágenes

    La investigación con células vivas cada vez requiere más del empleo de la adquisición de datos complementarios de forma simultánea para describir procesos intracelulares. Los registros simultáneos con técnicas tanto de adquisición de imágenes como de electrofisiología proporcionan una correlación valiosa entre ambos tipos de datos y se ha utilizado ampliamente para examinar diversas respuestas celulares.

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  • Historia de los clientes: Allegheny College

    Allegheny College

    En el Allegheny College utilizan nuestros instrumentos Axon Patch-Clamp para estudiar cómo el péptido beta amiloide bloquea los canales iónicos en la enfermedad de Alzheimer

    La Dra. Lauren French trabaja con estudiantes universitarios del Allegheny College para descubrir cómo el péptido beta amiloide implicado en la patología de la enfermedad de Alzheimer inhibe canales de potasio activados por calcio. Esta interacción de canales fue descrita por Yamamoto et al. (2011) y los estudiantes del laboratorio de la Dra. French están investigándolo usando el sistema de expresión en ovocitos de Xenopus.

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    Galería de vídeos de Axon Patch-Clamp

    Galería de vídeos de Axon Patch-Clamp

    Visite nuestra galería de vídeos de Axon Patch-Clamp para ver los videos, seminarios web y tutoriales destacados más recientes sobre nuestra solución de instrumentos Axon, incluidos los amplificadores Axon Patch-Clamp, el digitalizador Digidata 1550B más HumSilencer y el paquete de software pCLAMP.

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  • Electrofisiología de fijación en parche de membrana (patch-clamp)

    Electrofisiología de fijación en parche de membrana (patch-clamp)

    La técnica de fijación en parche de membrana (patch-clamp) es una versátil herramienta electrofisiológica para entender el comportamiento de los canales iónicos. Todas las célula expresan canales iónicos, pero las células que con más frecuencia se estudian con técnicas de patch-clamp son las neuronas, fibras musculares, cardiomiocitos y ovocitos que sobreexpresan canales de iones individuales. Aquí puede encontrar más información sobre la electrofisiología de patch-clamp y los fundamentos de los canales iónicos.

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Análisis de espigas poblacionales en pCLAMP 11

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