Los Organoides derivados de pacientes (PDO o simplemente “organoides”) se mencionan con frecuencia en relación con el descubrimiento de fármacos y la investigación médica. Este artículo explica qué son los PDO y cómo los científicos los derivan y cultivan a partir de tejido donado de pacientes. Estos métodos de biología 3D son relativamente nuevos y este campo de investigación se está desarrollando rápidamente.

Aprenda todo sobre cómo hacer crecer los PDO, incluidos:

Los organoides son versiones microscópicas en 3D de los órganos de los que se originan. Por ejemplo, los “intestinos” en miniatura pueden derivarse de tejido de biopsia sano o enfermo de los intestinos de un paciente. Es importante destacar que los PDO son réplicas fieles del tejido del que se originan, incluidos los diferentes tipos de células y cualquier enfermedad subyacente.

La imagen es de un organoide de cáncer colorrectal o “miniintestino”. La tinción azul muestra el ADN en células individuales y el color amarillo muestra espacios dentro de la estructura que son equivalentes a la cavidad intestinal. Se muestra un PDO 3D completo a la izquierda y a la derecha, se puede ver un corte a través del medio

Derivar y cultivar organoides en el laboratorio es laborioso, técnicamente exigente y costoso. Requiere la habilidad de científicos experimentados y equipos costosos, bastante aparte de las consideraciones éticas y los permisos para trabajar con tejido humano. (La Ley de tejido humano 2004 regula las actividades relativas a la extracción, almacenamiento, uso y eliminación de tejido humano). Sin embargo, el esfuerzo merece la pena, ya que las estructuras resultantes se utilizan cada vez más para ayudar a los científicos a comprender cómo funciona el cuerpo y como modelo para probar posibles nuevos fármacos.

¿Qué son los organoides derivados del paciente?

Los PDO son estructuras celulares 3D que surgen de “células madre adultas” dentro del tejido del paciente que pueden regenerarse para mantener y reparar el tejido dañado. Tienen “instrucciones preprogramadas” para dividir y formar los tipos de células especializadas que se encuentran en su órgano de origen específico. Las células, una vez formadas, se autoensamblan para replicar la misma “arquitectura” que se encuentra en el cuerpo. Por lo tanto, las estructuras que se forman se denominan organoides porque son “como un órgano”. Los PDO pueden derivarse de muchos órganos, como el intestino, el corazón, el hígado, el riñón, el páncreas, el pulmón, el cerebro y muchos más. El pequeño tamaño y la reproducción fiel del tejido del paciente fuera del paciente permiten a los científicos utilizar PDO para múltiples experimentos en el laboratorio que no se podrían realizar de forma ética en los propios pacientes. Por ejemplo, para probar y predecir con precisión las respuestas de los pacientes a fármacos novedosos.

Al igual que un árbol bonsai o una sandía baby, los PDO son versiones más pequeñas del original. Se necesita un microscopio para poder verlos con todo detalle. El diámetro de una sección del intestino delgado es de alrededor de 3 centímetros (0,03 metros) y un miniorganoide intestinal cultivado durante unos días en el laboratorio es de alrededor de 75 micrómetros (0,000075 metros), es decir, 400 veces más pequeño.

¿De dónde provienen los PDO?

El tejido del que derivan organoides se dona generosamente con el consentimiento del paciente. Esto suele ser de una biopsia con aguja tomada por un médico para determinar si el tejido está sano o si el paciente tiene cáncer u otra enfermedad. Solo se necesitan unos milímetros de la biopsia. Las posibilidades de establecer organoides en el cultivo son mayores con más tejido, pero aún no se puede garantizar que los organoides puedan derivarse de cada muestra.

Creación de organoides "miniintestinales" a partir del tejido intestinal del paciente: Un proceso paso a paso

El procedimiento para derivar organoides del tejido del paciente varía según el tipo de tejido. Los diferentes laboratorios tienen sus propios métodos preferidos que se adaptan a sus requisitos. Cuanto más aprendamos sobre el proceso, más eficientes y exitosos serán los métodos. El siguiente ejemplo es una descripción general de los pasos implicados en la creación de “miniintestinos” a partir de tejido intestinal. El proceso, desde la recepción de la muestra en el laboratorio de investigación hasta el cultivo en la incubadora, como preparación para la formación de los organoides, tarda alrededor de 4 horas. El crecimiento de los organoides tarda alrededor de 2 semanas en prepararse para el tejido.

1. El tejido de biopsia del paciente se asigna a las diversas pruebas necesarias para el diagnóstico. La diminuta pieza para la derivación de organoides se coloca en una solución de almacenamiento especial y se enfría para mantener las células vivas y funcionando normalmente mientras se transporta al laboratorio de investigación. (Se utiliza la misma solución para órganos enteros necesarios para el trasplante).
2. En el laboratorio, la muestra anonimizada se pulveriza con 70% de alcohol y se coloca en una cabina de seguridad biológica (BSC). El armario produce flujos de aire que pasan entre el operador y la muestra. Esto mantiene el aislamiento de ambos entre sí.
3. La muestra se enjuaga con líquido que contiene nutrientes y sales (“medios”) y se corta muy finamente en una placa de Petri utilizando bisturíes.
4. Se añade una solución enzimática y la mezcla se incuba en un baño de agua a temperatura corporal (37°C) durante aproximadamente 30 minutos. Esto descompone la estructura del tejido y libera las “células madre adultas” que permitirán que se formen los organoides.
5. La digestión enzimática se detiene con medios y la mezcla se centrifuga a alta velocidad dentro de una centrífuga. El sedimento resultante se resuspende en medios frescos. Este paso puede repetirse varias veces para “lavar” la muestra.
6. 
7. El sedimento que contiene diminutas grumos de células/fragmentos de tejido se enfría a 4 °C y se resuspende cuidadosamente en una mezcla de proteínas gelatinosas como Matrigel o su equivalente. Matrigel es líquido a 4 °C y forma un gel a temperatura ambiente. Este hidrogel proporciona factores de crecimiento y apoyo estructural para que las células se desarrollen en tres dimensiones. Las células se forman en una pelota que se puede redondear como un balón de fútbol con o sin protuberancias. Algunos organoides pueden ser bastante irregulares en su forma general.
8. Se colocan pequeñas gotas del fragmento celular y la mezcla de Matrigel en placas de Petri estériles. Estas gotas tienen aproximadamente el tamaño de una gota de agua promedio, es decir, 0,05ml. Se permite que los blobs se gelifiquen a temperatura ambiente. Se añade un suministro de líquido. Contiene nutrientes y factores adicionales que fomentan el crecimiento y el desarrollo de los organoides sin alterar la biología de las células. A continuación, la placa se mueve a una incubadora que mantiene una temperatura constante de 37°C y 5% de dióxido de carbono. (Condiciones estándar de cultivo celular).
9. El alimento líquido se renueva cada pocos días y los organoides se desarrollarán en aproximadamente 2 semanas. El rendimiento es muy variable con cualquier cosa, desde 0 hasta 100 organoides por biopsia. Esto puede depender del tipo de tejido y de cuánto haya de la muestra de biopsia original.

Cómo ampliar el número de organoides

Una vez que los PDO están completamente establecidos, pueden dividirse para sembrar muchas más copias. Esto puede hacerse en tan solo unos días o cada pocas semanas y varía según el tipo de órgano y con la persona, ya que los PDO derivados de cada paciente son únicos. Las células madre adultas dentro de los fragmentos organoides generarán nuevas células y formarán organoides de la misma manera que se formaron a partir de la muestra de tejido original, excepto que se forman más rápidamente después de que ya se hayan establecido. El proceso de dividir y volver a sembrar más copias se conoce como “subcultivo” o “pasaje” y puede repetirse varias veces, lo que da como resultado muchas copias adicionales. Estos pueden utilizarse para investigaciones a pequeña escala sobre genética y enfermedades.

Método para un subcultivo de organoides (pasaje)

1. Disuelva el Matrigel que rodea los organoides
2. Pase los organoides hacia arriba y hacia abajo a través de la estrecha abertura de la punta de una pipeta para disociarlos mecánicamente o divida los grupos de células utilizando una solución química que contenga enzimas.
3. Centrifugue para sedimentar las células y retire el líquido.
4. Mezcle las células/fragmentos organoides con Matrigel fresco y cultive como antes.

Expanda los organoides a escala utilizando nuestra tecnología de bioprocesos pendiente de patente

Cultivar los organoides manualmente puede suponer retos importantes para los investigadores, retrasando sus experimentos e incrementando los costes. Lo más frecuente es que no sea posible producir un número suficiente de organoides homogéneos en cuanto a calidad y tamaño. La uniformidad entre lotes es prácticamente imposible sin los procesos reproducibles estandarizados empleados en un entorno industrial regulado.

Molecular Devices es líder mundial en el aumento de escala y la fabricación industrial de organoides 3D derivados de humano. Gracias a nuestro exclusivo bioproceso pendiente de patente, en nuestro procedimiento semiautomatizado se utilizan condiciones monitorizadas y controladas para producir grandes cantidades de PDO estandarizados dentro de un rango de tamaño definido. Los rigurosos controles de calidad garantizan una reducida variabilidad entre lotes y entre usuarios.

Obtenga más información sobre nuestro servicio de expansión de organoides 3D Ready.

Descubra cómo se pueden utilizar los organoides aguas abajo en ensayos de alto rendimiento

Publicaciones recientes