Edición génica (CRISPR/Cas9) Avances recientes para mejorar el potencial clínico
Más de genes 3000 humanos se han correlacionado estrechamente con el cáncer y los trastornos genéticos. La dilucidación de mutaciones genéticas y enfermedades humanas es cada vez más urgente. Quizás el método de edición del genoma más funcional se vio influido por un mecanismo de respuesta inmunitaria adaptativo, por el cual las bacterias capturan y escinden el ADN viral para proteger contra los ataques virales. El mecanismo fue adaptado posteriormente por Doudna y Charpentier et al. y se nombró el sistema (Cas) agrupado de repetición palindrómica corta (CRISPR)/asociado a CRISPR regularmente interespaciada para estudiar alteraciones genómicas en humanos. Hoy en día, la edición de genes CRISPR/Cas es una parte integral del descubrimiento de fármacos basados en genes para descubrir genes diana y realizar eliminaciones, lo que ofrece información sobre el fenotipo resultante. Desde esta perspectiva, esta tecnología es un gran hito para correlacionar el genoma del paciente con el fenotipo y potenciar la medicina de precisión.
Como cualquier otra modalidad genómica, la terapia génica CRISPR/Cas debe administrarse de forma eficiente y fácil para el paciente. Sin embargo, los métodos actuales de administración de genes han demostrado efectos fuera del objetivo y una falta de reducción eficiente.
En este podcast de Drug Targets Review, el Dr. Pietro De Angeli, el Instituto para la Investigación Oftalmológica del Hospital Universitario Tübingen, y el Dr. Maarten, el Princess Maxima Center, analizan los perfiles de seguridad de los métodos de 9 administración CRISPR/Cas, así como las tendencias actuales que implican la escalabilidad y el uso de métodos de inteligencia artificial (IA).
Profundice en la conversación en la que analizamos las oportunidades que ofrece la tecnología CRISPR/Cas para revolucionar el descubrimiento de fármacos génicos.
Perfiles de seguridad centrados en: ADN, ARNm y RNP en la administración de CRISPR/Cas
Para que la edición de genes CRISPR/Cas9 funcione sin problemas, el complejo debe llegar al núcleo, donde puede localizar los genes diana.
La administración de CRISPR está mediada por ADN plásmido (ADNp), ARNm o ribonucleoproteínas (RNP), y las dos primeras imponen desafíos de seguridad. La administración a través del ADN o ARNm del plásmido a menudo puede dar lugar a la activación de la respuesta inmunitaria innata, y el ADNp tiene el riesgo añadido de incorporación en el genoma del huésped, lo que provoca efectos adversos a largo plazo. Aunque las estrategias ex-vivo pueden ayudar a predecir y mitigar estos riesgos, la especificidad de CRISPR/Cas9 sigue sin resolverse.
Mecanismo de CRISPR/Cas9. La enzima Cas9 se activa uniéndose primero a un ARN guía y, a continuación, a la secuencia genómica correspondiente que precede inmediatamente a la secuencia PAM de tres nucleótidos. Entonces, la enzima Cas9 genera un corte en la doble cadena y se utiliza la vía NHEJ o la HDR para reparar el ADN, lo que da lugar a una secuencia génica modificada.
Para reducir el riesgo de la edición de genes, los científicos están recurriendo a los RNP, que consisten en la proteína Cas9 en complejo con un ARNg dirigido. Este método de administración ofrece una mayor especificidad y seguridad. Hasta la fecha, Maarten señala la correlación inversa entre el tiempo que el complejo pasa en el huésped y la precisión de la edición del gen CRISPR/Cas9: “El ARNm o para el ADN, necesita hasta una semana para la transcripción y traducción de Cas9, mientras que un RNP está activo en cuanto entra en el núcleo y puede hacer el trabajo en menos de 24 horas. Cuanto más tiempo permanezca Cas9 en el núcleo, más probable será que encuentre y acumule sitios fuera del objetivo. Por eso, el método de edición génica más seguro es administrar un pulso de Cas9 muy corto a través de RNP”. Otra ventaja de los RNP es la facilidad de optimización, añade Pietro. “Cuando se utilizan RNP, es más fácil ajustar la concentración de los reactivos, lo que afecta a la eficiencia del objetivo. Mientras que en la administración de CRISPR basada en ADN, la eficiencia de la transfección y el número de copias de ADN son difíciles de predecir y ajustar”.
Otro desafío planteado por el ADN o el CRISPR/Cas9 basado en ARNm es que podría alterar el perfil transcriptómico y proteómico del huésped. Este cambio se produce principalmente porque el huésped reorganiza sus recursos energéticos para la transcripción y traducción de las formas de ADN y ARNm. La carga metabólica resultante puede afectar al metabolismo del huésped, lo que altera el transcriptoma y el proteasoma. Por el contrario, la administración de CRISPR/Cas9 como RNP es un complejo listo para funcionar y ejercer la edición génica deseada, por lo que no provoca un cambio en el genoma hacia la expresión de Cas9.
Aplicaciones ex-vivo: Navegar por la escalabilidad y viabilidad de CRISPR
El sistema CRISPR/Cas9 no se puede administrar al núcleo como un complejo desnudo, por lo que el vehículo de administración CRISPR adecuado desempeña un papel importante en la protección de la integridad del complejo. Para abordar los esfuerzos actuales, los científicos comparten el trabajo pionero de los laboratorios de investigación.
El Prof. David Liu, vicepresidente de la Facultad del Broad Institute of MIT y Harvard, diseñó nanopartículas lipídicas (LNP) de origen viral que pueden encapsular el complejo. Los LNP demostraron una administración eficiente en todas las formas de CRISPR/Cas9, incluido el RNP preformado. Esta maquinaria guió la administración del complejo a órganos específicos de interés (Banskota et al., 2022, Cell 185, 250–265). Mientras tanto, el laboratorio de Jennifer Doudna mejoró la especificidad del sitio de Cas9 al añadir señales de localización de los ácidos nucleicos al extremo C y N terminal de la proteína. Los experimentos in vivo confirmaron una edición genética precisa en el cerebro de los ratones (Stahl EC, et al., Mol Ther. 2023 2;31(8) de agosto2422-2438).
Aunque los métodos de administración continúan mejorando, el potencial clínico de la edición de genes CRISPR/Cas9 no se ha realizado completamente, principalmente porque la administración viral, asociada con la edición prolongada fuera de la diana, sigue siendo el estándar de referencia. Entre los métodos de administración no viral, la electroporación destaca por sus capacidades de administración seguras y robustas compatibles con RNP. Este método crea poros en la membrana celular, lo que permite una entrada perfecta de RNP en el citoplasma y evita su endocitosis o escape endosómico.
Cuando se trata de escalabilidad, surge otro conjunto de problemas. Aunque la endonucleasa Cas9 puede producirse en grandes lotes sin mucho coste, el ARN guía (ARNg) es específico no solo de la enfermedad o del enfoque terapéutico, sino también de las personas. Pietro cree que el camino hacia la ampliación del ARNg está pavimentado con riesgos. "En este momento, lo que veo como un problema no es la tecnología en sí, sino el marco legal. Las grandes empresas farmacéuticas se centran en los trastornos más comunes porque buscan oportunidades comercialmente viables. Un paciente que pertenece a este grupo tiene una mayor probabilidad de acceder a los tratamientos de edición génica. Para el tratamiento de enfermedades raras, las instituciones de investigación académicas y sin ánimo de lucro tienen que esforzarse por facilitar el acceso de los pacientes”. Según Maarten, el procedimiento regulador para las enfermedades raras debe ser diferente: “Para cada enfermedad, la seguridad del complejo debe demostrarse a través de datos ex-vivo sustanciales. Para las enfermedades raras con un número limitado de pacientes en todo el mundo, no es posible generar este informe completo. Actualmente, las iniciativas patrocinadas por Jennifer Doudna y otros expertos de CRISPR están colaborando con la FDA para suavizar los requisitos de datos preclínicos y la presentación de IND para enfermedades raras”. Esta propuesta implica el uso de la edición de genes ex-vivo para generar células editadas que se pueden administrar a los pacientes, de modo que la edición del genoma se considere un reactivo en lugar de un fármaco.
Mejora de la medicina de precisión CRISPR: La sinergia de CRISPR/Cas con IA y ML
Las herramientas de aprendizaje automático (ML) e IA, similares a su impacto en muchos otros sectores, se consideran factores revolucionarios en la edición de genes y el descubrimiento de fármacos impulsados por genes. En el caso de CRISPR/-Cas9, se pueden utilizar para ensamblar grandes conjuntos de datos de edición específica del sitio y fuera del objetivo y correlacionarlos con diferentes editores base o estructuras RNP 3D. Los algoritmos de aprendizaje automático pueden proporcionarle la secuencia de ARNg necesaria para dirigirse a un gen específico, así como todas las modificaciones a nivel de proteína necesarias para lograr el nivel de especificidad. Por lo tanto, los científicos ahora pueden diseñar el ARNg más seguro y eficiente.
También se han utilizado herramientas de IA para predecir la eficacia de más variantes evolucionadas de CRISPR/Cas9. Para mejorar la edición primaria, los investigadores desarrollaron nCas9 - Cas9 nickase fusionada con transcriptasa inversa - para optimizar varios tipos de edición del genoma, como mutaciones puntuales, inserciones y eliminaciones. Aunque este novedoso sistema ofrece una mejor eficiencia de edición primaria en teoría, su diseño y seguridad deben evaluarse minuciosamente, que es donde entra en juego el poder predictivo de las herramientas de IA. Maarten enfatiza el valor de la IA en el descubrimiento de fármacos basados en genes: "Nos ayuda a escanear cientos de combinaciones de Cas9 - gRNA para detectar las que 10 mejor funcionan".
El futuro de CRISPR: Transformación de los enfoques terapéuticos
La secuenciación del genoma convencional no es suficiente para dilucidar el contexto genético de las enfermedades. Aunque los investigadores pueden aislar células de un paciente y comparar el genoma con los sanos, esta comparación no cubre necesariamente las miles de mutaciones puntuales que contribuyen al fenotipo de la enfermedad. La edición del genoma de CRISPR/Cas9 ayuda a superar estas barreras y se beneficia enormemente del modelado preciso de la enfermedad y la medicina personalizada para actuar sobre mutaciones específicas. Para Pietro, el tratamiento es solo un lado de la moneda: “Podemos utilizarlo no solo como herramienta de tratamiento, sino también como medio para la investigación de enfermedades. Los modelos celulares 3D, como los organoides derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), son increíblemente valiosos para emular la biología humana compleja. Por lo tanto, al introducir una mutación asociada a la enfermedad en el genoma del iPSC, podemos generar cultivos celulares que puedan diferenciarse en el fenotipo de la enfermedad”. Merece la pena prestar atención a este aspecto de CRISPR/Cas9 porque los antecedentes genéticos de una enfermedad son primordiales para desarrollar potentes herramientas terapéuticas.
Por supuesto, el papel del modelado de células 3D no puede exagerarse. A través de las tecnologías de cultivo celular 3D y CRISPR/Cas9, los investigadores pueden generar modelos celulares isogénicos, que abarcan todo el panorama genómico con células extraídas de solo unos pocos pacientes.
Conclusión: próximos pasos en la investigación y aplicación de CRISPR
Las oportunidades terapéuticas desbloqueadas por CRISPR/Cas9 son amplias, especialmente en la edición de mutaciones puntuales y la reparación de genes ex vivo y, en el futuro, in vivo. Esto puede aumentar el acceso al tratamiento de los pacientes con enfermedades raras portadores de mutaciones previamente difíciles de tratar.
Es importante tener en cuenta que CRISPR no es una solución única. Especialmente cuando se habla de cáncer, no invalida el valor de los enfoques quimioterapéuticos. Por el contrario, puede crear un efecto sinérgico profundizando en las raíces genómicas de la enfermedad, mientras que el compuesto farmacológico inhibe los mecanismos asociados a la enfermedad a nivel quimioenzimático. La combinación de CRISPR con fármacos aprobados por la FDA puede acelerar su entrada en las principales aplicaciones de tratamiento del cáncer clínico.
En el podcast, exploramos métodos innovadores de administración de CRISPR, incluidos RNP, partículas virales modificadas genéticamente y formulaciones de nanopartículas, lo que destaca su potencial para impulsar las aplicaciones de CRISPR-Cas9 más cerca del uso clínico. Se hizo hincapié en la necesidad de técnicas de edición genética precisas y eficientes. Para respaldar estos avances científicos, los sistemas de adquisición de imágenes de alto contenido ImageXpress de Molecular Devices ofrecen información crítica al permitir la observación detallada de estos mecanismos de administración dentro de las células. Además, la integración de herramientas como los lectores de microplacas SpectraMax y el sistema FLIPR Penta mejora nuestra comprensión del crecimiento celular, el mantenimiento y la funcionalidad, especialmente cuando se trabaja con modelos complejos como organoides. Al analizar la importancia de agilizar el proceso de investigación, la conversación también tocó el papel de la automatización en los laboratorios modernos. Soluciones como el sistema automatizado de cultivo celular CellXpress.ai respaldan la automatización del proceso de cultivo celular, contribuyendo a resultados más fiables y reproducibles en la investigación científica. Hay disponibles soluciones automatizadas que agilizan el archivado de IND durante el cribado clonal, como el Selector de 2 colonias ClonePix con garantía de monoclonalidad. Las soluciones de automatización de laboratorio personalizadas se mencionaron como una forma de colaborar con científicos, adaptando los flujos de trabajo para satisfacer las necesidades específicas de sus estudios CRISPR-Cas9, alineando así las capacidades tecnológicas con la búsqueda de descubrimientos científicos innovadores.