Organoides 3D y automatización de ensayos celulares complejos [Podcast]
A medida que entramos en la era de los descubrimientos de fármacos complejos con la genoterapia y la medicina personalizada, necesitamos estar preparados para estudiar las enfermedades complejas, evaluar el efecto terapéutico de los fármacos e identificar efectos adversos que puedan suponer riesgos para la salud del paciente. Unfortunately, the current preclinical methods, such as animal models or 2D cell cultures, are inadequate. Dado que las propiedades físicas y químicas de estos modelos no representan la condición humana, la evaluación presintomática del fármaco no se traduce en éxito clínico. That’s why the development of 3D cell models, such as organoids, can be a huge milestone for improving the evaluation of drug efficacy and safety.
Dr. Oksana Sirenko is the senior manager of assay development at Molecular Devices, working on the development of complex cell-based models for 3D biology, as well as high-content imaging and assay automation.
En este extracto de pódcast, la Científica principal Oksana analiza las ventajas de los modelos de celdas 3D al tiempo que aborda los problemas en la generación de imágenes celulares 3D, como la calidad de imagen, el alto rendimiento, la automatización y el análisis.
Índice
1. ¿Por qué son tan útiles los modelos celulares 3D y los organoides 3D en la investigación de las enfermedades y el control de los fármacos?
The main problem in current disease research and drug development is that only about 3% of developed drugs make it to the clinic. La mayoría de los fármacos fracasan en los ensayos clínicos debido a la falta de eficacia o a problemas de intoxicación no deseados. Se necesitan mejores sistemas de análisis y modelos de enfermedades para facilitar el descubrimiento de los fármacos y predecir mejor el éxito en la consulta.
Hoy en día, la biología está cambiando hacia una mayor complejidad para los ensayos y modelos que se pueden utilizar para el descubrimiento y el desarrollo de fármacos. Se cree que los modelos 3D salvan la brecha entre los modelos celulares tradicionales y los tejidos y los órganos. 3D models, which include spheroids, organoids, and organ-on-a-chip, present a variety of human cell types, such as liver, immune cells, cardiac cells, and fibroblasts. Also, they can mimic the morphology of human tissue types, such as 3D tumor growth, crypts in intestinal organoids, neural tubes, or the flow of liquids. Finally, they represent at least some aspects of tissue functionality, from the metabolic activity of the liver to the beating of cardiac organoids to spikes of neuronal activity in brain organoids. Esta mayor complejidad y sofisticación nos permite simular los procesos en los tejidos, las interacciones entre los tipos de células, las respuestas a los fármacos, los efectos de la toxicidad y los procesos de intrusión de los fármacos en el tejido.
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Los organoides cerebrales muestran una organización que recuerda a un encéfalo en vías de crecimiento.
2. ¿Por qué la complejidad de los modelos 3D presenta un obstáculo/desafío para los investigadores?
Los ensayos celulares 2D tradicionales son más fáciles de trabajar, pero los ensayos 3D tienen una mayor previsibilidad y permiten la generación de datos más relevantes desde el punto de vista biológico. Sin embargo, a pesar del interés cada vez mayor en la investigación en 3D, la amplia adopción de los ensayos se ve limitada por los obstáculos técnicos y la complejidad de los ensayos, lo que conduce a mayores costes, menor rendimiento y falta de reproducibilidad. Una mayor complejidad presenta problemas, pero las posibilidades de desarrollo de instrumentos y automatización permitirían a los científicos ejecutar ensayos 3D con mayor rendimiento y precisión.
3. ¿Puede describir un flujo de trabajo típico para el desarrollo y análisis de organoides en 3D?
El flujo de trabajo típico para los ensayos de organoides contiene varios pasos, y este proceso suele ser mucho más largo que los pasos del flujo de trabajo 2D.
3D organoids can be derived from primary cells like intestinal organoids or induced pluripotent stem cells (iPSCs), e.g., neuronal or cardiac organoids. El flujo de trabajo puede comenzar a partir de un precultivo en 2D o la expansión de las células iPSC, seguido del paso de diferenciación. Después de eso, las células se mezclan con Matrigel y normalmente se desarrollan dentro de cúpulas de Matrigel, que también pueden incluir el paso y la expansión. Los organoides intestinales, el colorrectal, el pancreático y el hígado se suelen desarrollar utilizando este paso de la cúpula de Matrigel.
De forma alternativa, algunos otros tipos de organoides no requieren Matrigel, sino que se fabrican en placas de baja adherencia (p. ej., organoides cardíacos).
El desarrollo de organoides tarda de unos pocos días a varias semanas. Algunos protocolos incluso requieren unos meses. Este es un proceso muy tedioso y se beneficiará en gran medida de la automatización.
Por último, el análisis de punto final, ya sea un tratamiento con un fármaco, un análisis de infectividad vírica o una evaluación de la intoxicación, se configura en un formato de varios pocillos, con placas 96de 384 o de pocillos.
Next, cells are treated with drugs and processed for read-outs, which may include ATP assays, cell death assays, high-content imaging, or calcium oscillation.
4. ¿Puede decirme algo sobre cómo aplica los flujos de trabajo de modelos celulares 3D específicamente a su investigación?
Nos estamos centrando en el desarrollo de protocolos de automatización para cultivos celulares automáticos, así como en imágenes y análisis de imágenes automáticos para flujos de trabajo 3D complejos. Recientemente, hemos desarrollado y ejecutado ensayos de detección automáticos para encontrar fármacos contra el cáncer más eficientes para el cáncer de seno triple negativo . Utilizamos organoides de cáncer derivados de pacientes que representan unfenotipo de enfermedad resistente a los fármacos, y aplicamos la automatización a los organoides 3D de cultivo, simulamos la intervención de los fármacos y ejecutamos ensayos de punto final para identificar los compuestos que matan las células tumorales. Probamos una biblioteca de compuestos y descubrimos varios candidatos que tenían una mayor eficacia que los fármacos estándar actuales.
5. ¿Puede explicar cómo automatizar el flujo de trabajo para el desarrollo y análisis de los organoides?
Creamos una célula de trabajo automática en dispositivos moleculares que combina varios instrumentos en un sistema complejo. It includes a Beckman Biomek automated liquid handler, a LiCONiC automated incubator, our ImageXpress HT.ai high-content imaging system, our SpectraMax plate reader and AquaMax washer, and a Bionex automated centrifuge. Todos los componentes están conectados por un robot colaborativo, PreciseFlex 400 que puede mover placas de un instrumento a otro en los puntos temporales deseados, mientras que el software de programación garantiza que todos los elementos del sistema funcionen juntos sin problemas. Cada instrumento tiene varios protocolos diseñados para diferentes pasos, incluyendo la alimentación de las células y la placa de organoides, que puede ser llamada por el programador en los momentos indicados.
El nuevo Centro de Innovación de Organoides de Molecular Devices combina tecnologías de última generación con nuevos métodos de biología 3D para solucionar los problemas clave de ampliación de la biología 3D compleja.
Los métodos de diagnóstico por imágenes son otra área de tecnología muy interesante para la investigación de los organoides. Para obtener imágenes de los organoides o del órgano en un chip, necesitamos utilizar una óptica avanzada. El sistema de imágenes de alto contenido ImageXpress tiene varias ventajas para las muestras 3D:
Láseres y óptica confocal potentes nos permiten tomar la pila Z de múltiples imágenes empezando desde la parte inferior y subiendo con pasos como 5-10 micras La óptica confocal nos permite rechazar la luz que está desenfocada para que podamos obtener imágenes más nítidas a través de los organoides y Matrigel.
A continuación, nuestro software de análisis de imágenes MetaXpress analiza las imágenes en cada corte 2D y convierte los datos en espacio 3D. Puede obtener múltiples mediciones para describir los organoides, las células o los orgánulos subcelulares. Estas mediciones ayudan a definir los recuentos celulares, las intensidades, los volúmenes, el área, las distancias y más, lo que nos permite supervisar y cuantificar los cambios en la morfología, el contenido de las células y la viabilidad. También tenemos elementos de aprendizaje automático, donde los usuarios pueden capacitar software para reconocer objetos y características a fin de proporcionar un análisis más eficiente y perspicaz.
6. ¿Cómo puede la automatización ayudar específicamente en la investigación de sistemas complejos?
La automatización reduciría el trabajo y las tareas repetitivas, como alimentar las células cada día o cada dos días durante 2 meses. Además, ayudará a aumentar la investigación con un mayor rendimiento. Por ejemplo, en lugar de estudiar líneas 3 celulares o 5 mutaciones, la automatización le permitiría probar líneas 50 celulares para estudiar 100 mutaciones.
Las imágenes de alto contenido impulsadas por algoritmos de aprendizaje automático permitirán observar y describir una variedad de cambios en los organoides y las células, proporcionando múltiples lecturas y produciendo un conjunto de información valiosa sobre el crecimiento celular, la diferenciación, el ciclo celular, la muerte, la apoptosis, la expresión génica o la activación de las vías de señalización.
7. ¿Cómo volverá a utilizar estos sistemas en su futura investigación?
Además de los estudios de biología oncológica, estamos desarrollando de forma activa otros flujos de trabajo, incluyendo, entre otros, los organoides intestinales, el flujo de trabajo de las células madre, los organoides cardíacos y mucho más.
8. ¿Cómo evolucionará en el futuro la automatización del análisis de organoides 3D?
Pensamos que, a medida que la biología evolucione y la complejidad de los ensayos aumente, la automatización será cada vez más importante para comprender mejor los mecanismos de las enfermedades, acelerar el descubrimiento de los fármacos y, finalmente, encontrar mejores formas de tratar las enfermedades.
Al desarrollar nuevas y más avanzadas tecnologías e instrumentos, consideramos que contribuiremos aún más al progreso de las ciencias de la vida.
Comprender los principios básicos detrás de los organoides 3D - y los cuellos de botella actuales - es crucial para el éxito del desarrollo y la utilización de estos modelos avanzados para el descubrimiento de fármacos.
Escuche el pódcast completo
Si desea obtener más información, disfrute del podcast completo, “Ensayos complejos con Ian Shoemaker, Beckman Coulter Life Sciences y el Dr. Oksana Sirenko, Molecular Device”.
Aquí analizan una visión integral de la ciencia de la investigación de los organoides: descubren cómo se desarrollan los modelos de organoides, cómo se utilizan en la investigación de nuestros expertos y cómo la automatización del análisis de los organoides en 3D va a evolucionar en el futuro, ¡y mucho más!