Polarización de fluorescencia (PF)
Polarización de fluorescencia (PF)
La polarización de fluorescencia (PF) es una técnica muy utilizada para monitorizar eventos de unión en solución. Se puede utilizar para evaluar interacciones biomoleculares, como la unión proteína-anticuerpo y la hibridación de ADN, así como la actividad enzimática, y se ha adaptado a investigación básica y cribado de alto rendimiento.
Una pequeña molécula marcada con fluorescencia (marcador) que se excita con luz polarizada en un único plano emite luz en su mayoría despolarizada, ya que el marcador gira rápidamente durante el tiempo transcurrido entre la excitación y la emisión. Sin embargo, cuando el marcador se une a una molécula mucho mayor, gira más lentamente, y la luz emitida sigue estando en gran medida polarizada.
Factor G de polarización de fluorescencia
La polarización, expresada en unidades miliP (o mP), se calcula a partir de valores de intensidad de fluorescencia perpendicular (Iperp) y paralela (Ipara) detectada relativa a la dirección de la luz de excitación polarizada (véase la fórmula siguiente). El factor G (G) se utiliza para corregir los efectos de componentes ópticos como filtros, polarizadores y monocromadores, que pueden afectar a los valores de polarización.
Marcador no unido
Marcador unido a una molécula grande
Cuanto mayor es la molécula marcada con fluorescencia, o la molécula a la que se une el marcador, mayor es el valor mP.
Ventajas de la PF sobre otros ensayos de unión
La PF se puede emplear para estudiar las interacciones receptor-ligando, interacciones proteína-ADN, proteólisis, fluidez de la membrana, ensayos enzimáticos, etc. Los ensayos de PF se han utilizado con éxito para investigar una gran variedad de dianas, como quinasas, fosfatasas, proteasas, receptores acoplados a proteína G (GPCR) y receptores nucleares.
Las siguientes ventajas convierten a los ensayos de PF en especialmente adecuados para el cribado de alto rendimiento:
- Homogéneos (no se requieren pasos de lavado)
- No radioactivos
- Ratiométricos (longitud de onda única)
- Miniaturizables
Ensayos de fosfodiesterasas IMAP en lectores de microplacas multimodo SpectraMax
La tecnología IMAP® de Molecular Devices permite el ensayo rápido, homogéneo y no radioactivo de quinasas, fosfatasas y fosfodiesterasas y es adecuada tanto para el desarrollo de ensayos como para el cribado de alto rendimiento. Los ensayos IMAP se basan en la unión de la fosfatasa a nanopartículas o complejos de coordinación metálicos inmovilizados. Cuando las entidades de unión de IMAP se unen al sustrato fosforilado, el movimiento molecular del péptido se altera y la polarización de fluorescencia (PF) del marcaje fluorescente unido al péptido aumenta (figura 1, izquierda). En una versión TR-FRET del ensayo, la inclusión de un donador de terbio (Tb) permite que tenga lugar la transferencia de energía fluorescente cuando el sustrato fosforilado está presente (figura 1, derecha). Este ensayo se detecta en modo resuelto en el tiempo, lo que elimina prácticamente la interferencia de fluorescencia procedente de los componentes del ensayo o de los compuestos de un cribado. TR-FRET también ofrece flexibilidad en cuanto a tamaño y concentración del sustrato.
Las fosfodiesterasas (PDE) de nucleótidos cíclicos son un grupo de enzimas que degradan el enlace fosfodiéster del cAMP y el cGMP, segundos mensajeros que están implicados en diferentes procesos biológicos. Han surgido como una clase fundamental de dianas con elevado potencial terapéutico debido a su importancia clínica en áreas como enfermedades cardíacas, demencia, depresión y otras. Aquí demostramos cómo se realizan las curvas de dilución e inhibición de la enzima PDE con la tecnología IMAP usando los lectores de microplacas multimodo SpectraMax® con el software SoftMax® Pro.
Principio del ensayo de PDE IMAP PF y TR-FRET
Figura 1: Se lleva a cabo una reacción de la fosfodiesterasa utilizando sustratos marcados con fluorescencia. A continuación, se añade la solución de unión que contiene nanopartículas a base de M(III). En la lectura de PF (izquierda), el pequeño sustrato fluorescente fosforilado se une a las nanopartículas grandes, lo que reduce la velocidad rotacional del sustrato incrementando de este modo su polarización de fluorescencia. En la lectura de TR-FRET (derecha), el sustrato fosforilado y el donador de Tb están ambos unidos a la nanopartícula, lo que pone al donador de Tb en estrecha proximidad con el aceptor de fluoresceína en el sustrato y posibilitando la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET).
Simplifique el flujo de trabajo para medir la IgG en el desarrollo de líneas celulares
La medición de la producción de IgG es un paso crucial en muchas etapas del desarrollo y producción de anticuerpos monoclonales. Normalmente, para la cuantificación de la IgG se utilizan métodos que requieren instrumentos especiales y personal formado, como HPLC e interferometría de superficie, o bien ensayos muy laboriosos, como ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima). Aunque el ELISA es un método bien establecido para la cuantificación de proteínas, este es un proceso largo que consta de múltiples pasos. Aquí introducimos el uso del ensayo Valita®TITER de Valitacell para la medición de los títulos de IgG durante el proceso de desarrollo y producción de anticuerpos.
El ensayo ValitaTITER se basa en la detección de las interacciones del Fc de la IgG con la proteína G usando tecnología de polarización de fluorescencia (PF). Cada pocillo de la placa de 96 pocillos está recubierto con un péptido de unión a IgG marcado con fluorescencia, proteína G. Cuando se añaden las muestras a los pocillos, las moléculas de proteína G se resuspenden y se produce la unión. La velocidad de movimiento molecular de la proteína G se ralentiza cuando está unida a anticuerpos, lo que da lugar a un aumento del valor de PF (figura 2).
Principio del ensayo ValitaTITER usando la tecnología de PF
Figura 2: Las moléculas de proteína G libres son más pequeñas y giran más rápido en la solución tampón. Como consecuencia, la luz de excitación polarizada pierde polarización (imagen superior). Cuando las moléculas de proteína G se unen a los anticuerpos de la muestra, la rotación de los complejos más grandes se ralentiza, dando lugar a un aumento de los valores de PF (imagen inferior).